乙醛还原酶工程菌的构建以及与葡萄糖脱氢酶工程菌偶联还原制备R-CHBE

R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-CHBE)是多种药物的手性中间体,可由4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)立体选择性还原制备,而辅酶高效再生是绝大多数氧化还原酶实际应用的瓶颈。本研究从赭色掷抱酵母细胞ZJU010中克隆出NADPH依赖型乙醛还原酶ARI基因(alr),构建重组大肠杆菌E.coliBL21/pET-alr,并与葡萄糖脱氢酶的基因工程菌(BL21/pET-gdh)进行偶联转化COBE。合理调整双菌双酶比例,当BL21/pET-alr和BL21/pET-gdh的湿菌重比为6∶1时,CHBE的产量达到最高,无需添加辅酶,转化22h摩尔转化率达到95.88%,产物R-CHBE的对映体过量值ee为96%,较好地实现了双酶偶联制备R-CHBE。

Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因插入失活载体的构建

合成气/富CO废气发酵制乙醇是一项新的乙醇生产技术。该技术能以生物质、有机废物气化产生的合成气(主要成分CO,CO2和H2)或炼钢厂的废气为原料,利用特殊的微生物将其发酵为乙醇,因而在生物质、富CO废气及一些有毒或难降解的有机废物利用上将发挥重要作用。Clostridium ljungdahlii是最早发现也是研究得最多的合成气乙醇发酵菌株,其全基因组序列已报道。乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶是Clostridiumljungdahlii乙醇合成过程中催化乙酸/乙醛转化的一个重要的酶。本研究根据Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因序列设计了Ⅱ型内含子插入识别位点及相关引物,其最适插入位点为基因的有义链第360与361位核苷酸之间,之后采用重叠延伸PCR法扩增了内含子的IBS,EBS1d和EBS2序列,在质粒pMTL007的基础上构建了用于Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因插入失活的质粒pMTL007-Clj-aor-360s,经酶切和DNA测序验证,再转化含质粒pMCljS的大肠杆菌E.coli XL1-blue,利用氯霉素和奇霉素双抗性筛选获得了经甲基化修饰的目的质粒,可用于下一步电转化Clostridium ljungdahlii以构建Clostridiumljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因失活的基因工程菌。

GRHPR在肝细胞癌组织和细胞中的表达及意义

目的研究乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)在肝细胞癌(HCC)中的表达,与肝癌细胞增殖相关性,及其对HCC患者预后分析。方法采用Western blot检测GRHPR在8例肝癌及癌旁组织标本和肝癌细胞株的表达情况;采用免疫组织化学方法检测120例HCC及相应癌旁组织微阵列中GRHPR和增殖指标Ki-67的表达情况,并结合肝癌临床病理资料分析GRHPR与HCC患者的年龄、性别、肿瘤分级、大小和转移及血清甲胎蛋白(AFP)等因素之间的关系,并对上述病例进行随访,应用Kaplan-Meier法分析HCC患者生存率。结果采用Western blot检测发现GRHPR在新鲜活体肿瘤组织中表达比在癌旁组织中表达减少,在肿瘤细胞株中表达也减少;免疫组织化学检测结果显示GRHPR表达与Ki-67呈负相关性(r=-0.870,P<0.05);在癌和相应癌旁组织中GRHPR阴性表达的患者生存率低于GRHPR阳性患者(P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示GRHPR在HCC中的阳性表达与患者总生存率的增加显著相关(P<0.01)。结论GRHPR在癌和癌旁组织缺失提示GRHPR可能是肝癌发生、发展过程中的保护因素。