彩叶草羟基丙酮酸还原酶基因CbHPR的克隆及分析

为研究C3植物彩叶草的光呼吸作用,根据获得的HPR EST片段,采用RACE和文库结合的方法,克隆了HPR蛋白的全长cDNA,命名为CbHPR（GenBank accessionNo.EF125078）.序列分析结果表明,该cDNA全长为1393bp,包含一个1161bp的ORF框,编码386个氨基酸;其5′-UTR区含有2个终止子TGA,3′-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA;CbHPR蛋白C端具定位于微体的转运信号S-K-L,具有1个保守的2-Hacid_dh_Cdo-main结构域（D-异构体-羟基酸脱氢酶-NAD结合结构域）、5个S磷酸化位点、4个T磷酸化位点和6个Y磷酸化位点.PSORT定位分析显示,CbHPR定位于叶的过氧化物酶体中.多序列比较和进化树分析表明,CbHPR与其他植物HPR一致性高达87%-90%,与拟南芥AtHPR具有相似的功能.CbHPR基因的克隆与分析,为进一步研究该基因在彩叶草的光呼吸作用中的表达调控奠定了基础.

丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因RNAi表达载体的构建

为研究丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因(SmHPPR)在丹酚酸类化合物生物合成中的作用,构建SmHPPR的RNAi植物表达载体。根据SmHPPR的序列,设计4对含有酶切位点的特异性引物,以丹参无菌苗叶片cDNA为模板,分别扩增两段目的基因的正反向片段(约402 bp和346 bp),经T-载体克隆并测序后,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置(正向目的片段插人中间载体pKANNIBAL内含子左侧,反向目的片段插入该载体内含子右侧),构建了含有发夹结构的RNAi植物表达载体pART27-HPPR1sa、pART27-HPPR2sa和阴性对照载体pART27-Intron。利用三亲杂交法,将这3个载体导入到发根农杆菌LBA9402中。酶切鉴定和PCR扩增结果表明RNAi表达载体构建成功并成功导入到发根农杆菌LBA9402中,为下一步研究SmHPPR基因的功能奠定基础。

NCS对离体萝卜子叶微体中酶活性及细胞超微结构的影响

研究了天然生物活性物质narciclasine NCS 对离体萝卜子叶光下生长发育期间叶绿素含量变化、异柠檬酸裂解酶及羟基丙酮酸还原酶活性的影响;并对萝卜子叶细胞的超微结构变化进行了观察.结果表明,NCS明显抑制光下培养的离体萝卜子叶叶绿素含量及鲜重增加,对异柠檬酸裂解酶及羟基丙酮酸还原酶活性也显示出明显的抑制作用.电镜观察显示,NCS对蛋白体及脂质体的降解、叶绿体的发育也表现出强烈的抑制效应.NCS的各种抑制作用均随其浓度的增加而增加,而且高浓度的NCS 10-5mol/L 基本上完全阻止了离体萝卜子叶的光下生长及其转绿.

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析。以‘太原806’、‘小白麦’、‘京冬8’及‘京411’为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据。序列分析表明:TaHPPR基因含有1个975 bp的完整开放阅读框,编码324个氨基酸;Ta HPPR蛋白含有一个NAD-binding domain结构域。系统进化分析表明:TaHPPR基因与二粒小麦处于同一分支,其亲缘关系最近。荧光定量表达分析表明:TaHPPR基因在小麦根、小穗(除去雄蕊)、叶鞘均有表达,其中,根中表达量最高;在低温、干旱、高盐和ABA胁迫处理下Ta HPPR基因表达均有所下降;在高抗盐品种‘京冬8’中,TaHPPR基因表达升高,而在敏感品种‘小白麦’和较敏感品种‘京411’中,TaHPPR基因表达受到抑制。亚细胞定位结果显示,TaHPPR蛋白主要在线粒体中表达,过表达TaHPPR基因可能增加小麦的抗盐性。本研究分析了TaHPPR在小麦逆境应答及不同品种中盐胁迫处理下的表达特性,为研究小麦抗逆育种分子机制提供新基因资源和新的思路。

GRHPR在肝细胞癌组织和细胞中的表达及意义

目的研究乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)在肝细胞癌(HCC)中的表达,与肝癌细胞增殖相关性,及其对HCC患者预后分析。方法采用Western blot检测GRHPR在8例肝癌及癌旁组织标本和肝癌细胞株的表达情况;采用免疫组织化学方法检测120例HCC及相应癌旁组织微阵列中GRHPR和增殖指标Ki-67的表达情况,并结合肝癌临床病理资料分析GRHPR与HCC患者的年龄、性别、肿瘤分级、大小和转移及血清甲胎蛋白(AFP)等因素之间的关系,并对上述病例进行随访,应用Kaplan-Meier法分析HCC患者生存率。结果采用Western blot检测发现GRHPR在新鲜活体肿瘤组织中表达比在癌旁组织中表达减少,在肿瘤细胞株中表达也减少;免疫组织化学检测结果显示GRHPR表达与Ki-67呈负相关性(r=-0.870,P<0.05);在癌和相应癌旁组织中GRHPR阴性表达的患者生存率低于GRHPR阳性患者(P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示GRHPR在HCC中的阳性表达与患者总生存率的增加显著相关(P<0.01)。结论GRHPR在癌和癌旁组织缺失提示GRHPR可能是肝癌发生、发展过程中的保护因素。

丹参SmHPPR1基因调控丹酚酸生物合成的研究

丹参是临床上治疗心脑血管疾病的常用中药,其主要水溶性活性成分为迷迭香酸和丹酚酸B,由苯丙烷类代谢途径产生。4-羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)是苯丙烷代谢途径中的关键酶。本课题组前期在丹参中克隆了SmHPPR1基因并构建了植物表达载体。在此基础上,获得了携带SmHPPR1的转基因拟南芥阳性植株并测定4-羟基苯乳酸的含量;诱导了过表达SmHPPR1丹参毛状根并进行有效成分含量测定和转录组分析。结果显示:携带SmHPPR1的T1代转基因拟南芥中4-羟基苯乳酸含量为0.594 mg·g^(-1);SmHPPR1-OE-3毛状根中的迷迭香酸、丹酚酸B、总丹酚酸含量分别是control-3毛状根的1.09、1.29、1.15倍,丹参素是control-3毛状根的36.26%;转录组分析显示,SmHPPR1过表达引起了SmTAT2表达量上调;蛋白-蛋白相互作用表明CYT(TR74706_c0_g1)、NADP^(+)(TR26565_c0_g1)和NADP^(+)(TR68771_c0_g1)是网络的中心节点并参与代谢过程、细胞过程等。以上研究表明,SmHPPR1在携带SmHPPR1的转基因拟南芥中能催化4-羟基苯丙酮酸还原为4-羟基苯乳酸;丹参毛状根中过表达SmHPPR1可以通过协同调控其他途径基因来提高丹酚酸的含量。