基于抗炎和促红细胞生成作用的九味补血口服液改善血虚证小鼠造血功能的机制研究

为探讨九味补血口服液改善血虚证小鼠造血功能的作用及机制,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术鉴定九味补血口服液中的化学成分;利用蛋白互作和网络分析手段筛选九味补血口服液治疗贫血的关键网络靶点,并对关键网络靶点进行基因本体(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;同时采用分子对接技术将潜在活性成分与关键网络靶点对接,评估活性分子与靶点的结合能力。在动物实验中,采用环磷酰胺建立小鼠血虚模型,设立对照组和模型组,复方阿胶浆口服液组(30 mL/kg)及九味补血口服液高、中、低剂量组(10.0、5.0、2.5 mL/kg),每天灌胃给药1次,连续32 d。检测全血中红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)水平,并利用qRT-PCR法和免疫印迹法对关键靶点及通路在血虚证小鼠肾脏的表达进行验证。结果显示,在91种鉴定的九味补血口服液化学成分中,满足口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18的条件,且具有相应靶点的潜在活性成分共计15个。分析九味补血口服液成分-血虚疾病靶点网络,获得九味补血口服液治疗贫血的关键靶点15个,主要富集于核因子-κB(NF-κB)信号通路(NF-κB signaling pathway)、代谢通路(Metabolic pathway)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll样受体信号(Toll-like receptor signaling pathway)通路等。分子对接结果显示,甘草苷、橙皮素与Toll样受体4(TLR4)具有强烈的结合能力。动物实验结果显示,与对照组相比,血虚证小鼠RBC、HGB和HCT水平明显降低,TLR4/NF-κB p65介导的炎性信号增强,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)介导的促红细胞生成信号受抑制(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,九味补血口服液各剂量组可显著升高血虚证小鼠RBC、HGB和HCT水平,不同程度地逆转TLR4、NF-κB p65变化,并上调HIF-1α、EPO mRNA或蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01)。因此,九味补血口服液可以改善血虚证小鼠的贫血状态,其机制可能与促进肾脏中HIF-1α/EPO介导的促红细胞生成作用、减少TLR4/NF-κB p65介导的肾脏炎症反应相关。

九味补血口服液HPLC-ELSD指纹图谱方法研究

目的建立九味补血口服液的HPLC-ELSD特征图谱,提高九味补血口服液质量标准。方法采用Waters Sunfire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.05%甲酸溶液为流动相梯度洗脱,体积流量为1.0 ml/min,柱温:30℃,漂移管温度为45℃,载气压力为3.6 bar。结果建立的HPLC-ELSD特征图谱分离度好,共标定出25个特征峰,通过对照品比对确定了人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd,黄芪甲苷,甘草苷,柚皮苷,橙皮苷,川陈皮素9个特征性成分。结论研究建立的九味补血口服液HPLC-ELSD特征图谱方法具有良好稳定性和重复性,将更为有效控制九味补血口服液的质量。

九味补血口服液质量标准研究

目的：提高九味补血口服液质量标准。方法：采用薄层色谱法对人参、绞股蓝、黄芪进行定性鉴别,采用HPLC法对五味子中五味子醇甲进行定量分析。结果：人参与绞股蓝、黄芪的薄层色谱均具有特征性的清晰斑点,阴性溶液无干扰;五味子醇甲在0.05100~1.5300μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系,平均加样回收率为100.97%（RSD=0.91%）。结论：研究建立的定性鉴别与定量分析方法灵敏、准确,具有良好专属性和重现性,更能有效控制九味补血口服液的质量。

九味补血口服液在大鼠体内的吸收与代谢研究

目的:研究九味补血口服液在大鼠血浆、尿液中的吸收及代谢情况。方法:采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术,大鼠灌胃3 d后采血样、尿液分析。结果:九味补血口服液中五味子活性成分吸收后主要分布于血浆中;陈皮成分5-去甲基川陈皮素、5-羟基酸橙素等,黄芪成分毛蕊异黄酮、芒柄花黄素等,甘草活性成分甘草素等吸收后主要经尿液排出体外。结论:本研究在血样与尿样中共鉴定出了27个原型成分,发现五味子、陈皮主要组分经吸收后大量分布于血浆中,表明五味子、陈皮也可能是本药品潜在药效物质,研究结果为阐明该制剂的药效物质基础和药理作用提供依据。

九味补血口服液的胃肠道稳定性研究

目的研究九味补血口服液在胃肠道环境下的稳定性。方法采用UPLC-MS方法,分别在人工胃液、人工肠液的酸碱物理环境及消化酶作用下检测多成分含量的变化。结果口服液中的13种主要成分在人工胃液中有7种发生了代谢,导致其含有量变化超过30%;而口服液中的13种主要成分在人工肠液中只有1种含量变化超过10%,可认为在肠液中的稳定性良好。结论该研究为后续进一步的药理作用研究提供有力支持。

基于整合网络药理学和实验验证探究九味补血口服液调控Glu/GABA动态平衡改善失眠大鼠睡眠机制的研究

本研究拟通过网络药理学分析、分子对接结合体内实验验证,探究九味补血口服液对失眠大鼠的睡眠改善机制。利用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析结合数据库获取九味补血口服液的化学成分及其候选靶标,并通过蛋白质互作和网络分析,筛选九味补血口服液治疗失眠的关键网络靶标和潜在活性成分,进行生物功能富集及通路分析。再采用分子对接技术对上述关键靶标和活性成分进行结合能力预测;通过对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射复制大鼠失眠模型,给予九味补血口服液(2、4、8 mL·kg^(-1))干预7天,开展戊巴比妥钠阈上剂量诱导睡眠实验,考察九味补血口服液协同助眠作用。检测海马和下丘脑组织中谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)含量,比色法检测海马组织中谷氨酸脱羧酶1 (GAD67)酶活力,qRT-PCR和免疫印迹法检测海马组织中GAD67、γ-氨基丁酸A受体α1(GABRA1)、γ-氨基丁酸A受体β2 (GABRB2) mRNA和蛋白质表达水平。动物实验经广西壮族自治区中医药研究院实验动物伦理委员会批准(编号2022060802)。结果表明,通过构建九味补血口服液中药-成分-失眠疾病靶点网络,获得该品种治疗失眠的16个关键网络靶标和16个潜在活性成分。网络药理学和分子对接分析显示,白术内酯III等16个潜在活性成分与GABRA1、GABRB2蛋白质具有潜在的结合能力。在动物实验验证中,与失眠大鼠模型组相比,九味补血口服液显著缩短失眠大鼠睡眠潜伏期,延长睡眠时长,并明显提高其海马组织中GAD67酶活力及GABA生成量,以及GAD67、GABAA受体亚基GABRA1、GABRB2的mRNA和蛋白质表达水平,而降低下丘脑组织中Glu含量,最终降低下丘脑和海马中Glu/GABA比值,保持脑内Glu、GABA动态平衡。综上表明,九味补血口服液可以改善失眠大鼠症状,促进海马、下丘脑内Glu和GABA平衡,减轻失眠后脑内兴奋性神经毒性,其机制可能与增强GAD67表达及酶活力,促进海马GABAA受体亚基GABRA1、GABRB2介导的抑制性神经活动有关。

九味补血口服液质量标准的修订建议

目的补充修订九味补血口服液质量标准。方法采用薄层色谱法定性鉴别处方中的人参、五味子；采用蒸发光散射检测HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷。结果人参、五味子的薄层鉴别斑点清晰，阴性对照无干扰；黄芪甲苷0．406～3．042ug与峰面积的线性关系良好（r=0．9996），平均回收率为97．66％，RSD=1．47％。结论所建方法操作简单、专属性和重复性良好，可作为九味补血口服液的质量控制方法。

HPLC-ELSD测定九味补血口服液中黄芪甲苷的含量

目的建立高效液相-蒸发光散射检测法测定九味补血口服液黄芪甲苷的含量。方法采用迪马(150mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,乙腈-水(35∶65)为流动相,流速1.0ml/min;ELSD参数:漂移管温度为90℃,气流速为2.7ml/min。结果黄芪甲苷在0.4056μg～3.042μg的线性关系良好(r=0.9996)。结论方法简便准确,重现性好,灵敏度高。