九香虫水煎液经口急性毒性试验

目的 明确九香虫水煎液对小鼠的急性毒性,初步评价其安全性,为安全用药提供依据。方法 根据《中药、天然药物急性毒性研究的技术指导原则》([Z]GPT2-1),采用最大耐受量法观察九香虫水煎液对小鼠的急性毒性。将昆明小鼠随机分为对照组和给药组,每组20只,雌雄各半;连续灌胃14 d,每天1次;对照组给予生理盐水,给药组给予20 g/kg九香虫水煎液;观察小鼠中毒症状和活动反应,每2天称量小鼠体重,进食进水量。14 d后解剖小鼠,称量器官重量并进行HE染色,收集血清检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)指标。结果 与对照组相比,实验组小鼠无中毒症状和异常活动反应,体重、进食量和进水量、各器官脏器系数、血液ALT、AST、Cre、BUN指标无显著差异。给药后小鼠肝、脾、肾、胃、睾丸、卵巢未见病理性异常。结论 九香虫水煎液MTD(最大耐受剂量)>20 g/kg,无致死作用,具有较高的安全性。

九香虫的营养评价及酶解多肽制备工艺优化

目的:探究九香虫营养成分组成与九香虫多肽的最佳酶解工艺条件。方法:按照国标法测定脂肪、蛋白质、总糖含量和脂肪酸组成,采用标准曲线法测定总黄酮和多酚含量;以九香虫多肽得率为指标,采用响应面法优化九香虫的酶解工艺条件;采用氨基酸分析仪、高效凝胶渗透色谱法测定九香虫酶解物的氨基酸组成和相对分子质量分布;考察九香虫酶解物对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力及总还原能力。结果:九香虫粗脂肪含量为43.40%,蛋白质含量为37.08%,总糖含量为7.64%,总黄酮含量为1.67%,总酚含量为1.90%;九香虫最佳酶解工艺为蒸煮时间5 h,酶解pH 10,酶解时间6 h,酶解温度55℃,该条件下多肽得率为35.74%;九香虫酶解物必需氨基酸和非必需氨基酸的比值为70.46%,九香虫酶解物相对分子质量<1000所占比例为88.1%;九香虫酶解物质量浓度为1.0 mg/mL时ABTS+自由基清除率达到88.44%。结论:在最佳酶解工艺下,九香虫多肽得率为35.74%,具有较高的营养价值和较好的抗氧化活性。

九香虫脂肪酸合酶基因克隆、生物信息学分析及时序表达谱研究

九香虫Aspongopus chinensis Dallas,1851是中国传统药食两用资源昆虫,其需求量日增。然其存在严格的生殖滞育现象,脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase,FASN)与昆虫滞育关系密切。本文根据九香虫转录组数据设计了FASN特异性引物,提取九香虫总RNA,利用PCR技术克隆出九香虫脂肪酸合酶基因(AcFASN),利用生物信息学软件对其进行了生物信息学和同源进化树分析,并通过实时荧光定量试验获取了AcFASN在九香虫中的时序表达图谱。结果显示:九香虫AcFASN基因全长7092 bp,编码2363个氨基酸;九香虫AcFASN是亲水性蛋白质,亚细胞主要定位于细胞质,是一种无信号肽、非跨膜、非分泌型蛋白。同源进化树分析表明,AcFASN氨基酸序列与茶翅蝽Halyomorpha halys的FASN氨基酸序列进化关系较近。时序表达谱显示AcFASN基因在滞育期表达量较高,预示着AcFASN基因极可能通过改变九香虫体内AcFASN的表达量来影响九香虫滞育等生命活动。

基于网络药理学研究阿魏、九香虫治疗胃癌的作用机制

目的 通过网络药理学方法探讨阿魏、九香虫治疗胃癌的作用机制。方法 利用中药综合数据库(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID)与文献检索获取阿魏、九香虫的活性成分,将化学活性成分导入PubChem统一格式。利用SwissTargetPrediction数据库预测活性成分靶点,利用比较毒物基因组学数据库(Compargtive Toxicogenomics Database,CTD)获取胃癌靶点,并与药物所对应的靶点比较,筛选出共同部分,然后采用Cytoscape3.8.0软件搭建“药物-成分-靶点-疾病”网络。通过String数据库获取共有靶点之间的相互作用关系,并筛选出关键靶点。将共有靶点导入注释、可视化和集成数据库(the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery,DAVID)进行基因本体(gene ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。结果 从阿魏中获得抗胃癌相关活性成分15个,九香虫21个,从阿魏、九香虫中发现共同作用于胃癌的靶点112个。获得丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein 90α family class A member 1,HSP90AA1)、信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、SRC基因等5个与胃癌相关的关键靶点,与胃癌密切联系的通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)信号通路、MAPK信号通路、细胞周期通路等。结论 阿魏、九香虫能够影响小血管生成,抑制细胞增殖、分化,促进细胞凋亡,可能通过抑制细胞周期G1期、G2/M期来发挥抗胃癌作用。

两种色型九香虫臭腺分泌物分析研究

为比较分析两种色型九香虫臭腺分泌物的化学成分及含量差异,采用直接收集法获取两种色型九香虫臭腺分泌物,气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测两种色型九香虫臭腺分泌物的化学组成及含量变化。结果表明,两种色型九香虫臭腺分泌物共检测出61种化合物,以烷类化合物的相对含量最高;两种色型间在化合物组成成分及含量方面差异明显,其中黑色型检测出33种化合物,棕色型43种;两种色型共有化合物15种,其中以十三烷的含量最高,分别占到35.16%和51.83%。两种色型九香虫臭腺分泌物化合物组成种类丰富,棕色型的化学组成远比黑色型复杂。

固相净化结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定九香虫及其成方制剂中10种真菌毒素

目的:建立一种采用固相净化结合超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS)同时测定九香虫及其3种成方制剂中10种真菌毒素的方法。方法:样品经乙腈-水-甲酸(84∶15.9∶0.1)提取,MFC100固相净化柱净化,采用UHPLC-MS在多反应监测(MRM)模式下进行测定,外标法定量。结果:10种真菌毒素的含量在各自质量浓度范围内具有较好的线性关系(r>0.999),目标化合物在低、中、高3个质量浓度下的平均回收率为62.3%~106.6%(RSD<10%),定量限(LOQ)为0.17~88.04μg·kg^(-1)。结论:该法前处理步骤简便,净化效果良好,灵敏度高,准确性好,适合于九香虫及其成方制剂中10种真菌毒素的测定。

九香虫多糖提取条件筛选及其对人乳腺癌HCC1937细胞的抑制作用

【目的】推进中药九香虫Aspongopus chinensis开发与利用,探究九香虫多糖对人乳腺癌HCC1937细胞的作用效果。【方法】采用单因素实验和正交试验探究水提醇沉法提取九香虫多糖的最优条件,基于九香虫多糖提取率来确定最佳液料比、提取温度、提取时间和提取次数;CCK-8法检测0,2,4,6,8和10 mg/mL九香虫多糖作用后24和48 h时对人乳腺癌HCC1937细胞增殖的影响;0,4和8 mg/mL九香虫多糖处理HCC1937细胞,0,24和48 h时倒置显微镜下观察HCC1937细胞形态并于24和48 h时利用Hoechst 33258染色检测HCC1937细胞凋亡,24 h时利用流式细胞术检测HCC1937细胞的细胞周期并利用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。【结果】正交试验结果表明,九香虫多糖的最佳提取条件为:液料比40 mL/g、提取温度90℃、提取时间3 h和提取次数3次,在上述条件下九香虫多糖提取率最高,为5.067%±0.071%。4,6,8和10 mg/mL九香虫多糖能够显著抑制HCC1937细胞增殖;8 mg/mL九香虫多糖阻滞HCC1937细胞的细胞周期于S期;4和8 mg/mL九香虫多糖促进HCC1937细胞凋亡,上调促凋亡蛋白CASPASE-3,CASPASE-8和BAX表达,下调抑凋亡蛋白BCL-2表达。【结论】采用水提醇沉法在最优提取条件下提取九香虫多糖的最高提取率为5.067%±0.071%,最优提取条件为:液料比40 mL/g、提取温度90℃、提取时间3 h和提取次数3次;九香虫多糖具有体外抑制人乳腺癌HCC1937细胞的活性,且可能是通过死亡受体通路和线粒通路引发细胞凋亡。

基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对九香虫及其混伪品进行鉴定

目的:基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对市售九香虫、小皱蝽及其掺杂样品进行鉴定。方法:利用通用引物COI进行扩增并测序,构建NJ系统发育树、二级结构并计算种内种间遗传距离;基于COI序列设计九香虫、小皱蝽特异性引物并进行电泳,比较电泳条带;基于COI引物进行SBYR荧光定量PCR,观察单一样品及不同比例混合样品的熔解曲线及其Tm值。结果:利用MEGA 11.0软件分析显示九香虫、小皱蝽分别单独聚为一支,其种间遗传距离均大于0.22,种内遗传距离均小于0.02;两者的二级结构在整体框架具有明显不同。基于特异性引物扩增的九香虫、小皱蝽均出现单一条带,不同比例的混合样品与混合引物进行扩增均出现2条条带。基于COI引物扩增的九香虫、小皱蝽熔解曲线Tm值分别为75℃、89℃,不同比例混合样品的熔解曲线Tm值分别在75.00℃、89.00℃出现两个峰值。结论:DNA条形码能够及二级结构准确鉴定九香虫、小皱蝽;多重PCR及基于SBYR荧光定量PCR不仅能够准确对单一九香虫、小皱蝽进行鉴定,也能够对不同比例的混合样品进行准确鉴定。

MAPKs通路在九香虫提取液对锰致大鼠睾丸损伤中的作用

目的探究MAPK信号通路在九香虫石油醚提取液保护染锰大鼠睾丸损伤中的作用。方法将60只雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、九香虫提取液低、中、高剂量干预组和阳性组,每组10只。按照15 mg/kg BW腹腔注射MnCl_(2)溶液制备损伤模型(空白对照组给予生理盐水),干预组按照50、100、200 mg/kg BW灌胃九香虫提取液,阳性组按照1.25 g/kg灌胃金匮肾气丸水溶液,时间均为30 d。通过HE染色观察睾丸结构变化;qPCR检测睾丸组织中MAPK信号通路中相关mRNA的表达水平;Western blot检测睾丸中MAPK信号通路相关蛋白的表达情况。结果形态学结果显示,模型组大鼠生精小管结构遭到破坏,生精小管间隙增宽,各级生精细胞排列紊乱、层数明显减少,各干预组大鼠睾丸生精小管完整度、生精上皮排列情况均有明显改善。qPCR结果显示,与空白组相比,模型组的睾丸组织中JNK1、p38 mRNA的表达显著上调(P<0.05),ERK1 mRNA的表达则显著下调(P<0.05);九香虫提取液干预后,JNK1、p38 mRNA的表达显著下调(P<0.05),ERK1 mRNA则显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示,各干预组p-JNK/JNK和p-p38/p38蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05),而p-ERK/ERK蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.05)。结论九香虫提取液能改善锰暴露导致的生殖器官损伤,其机制可能与激活MAPK信号通路相关。

炒九香虫配方颗粒含量测定和特征图谱测定方法研究

目的:建立炒九香虫配方颗粒含量测定和特征图谱分析方法。方法:采用高效液相色谱法(UPLC)对炒九香虫配方颗粒中的犬尿喹啉酸进行含量测定,流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,流速为0.4 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为240 nm。更换检测波长为254 nm建立炒九香虫配方颗粒的特征图谱,质谱解析指认共有峰。结果犬尿喹啉酸在2.92~292.64μg/mL呈良好的线性关系(R 2=0.9995),平均回收率97.2%(RSD为3.6%,n=9),精密度、稳定性、重复性的RSD均小于2%;炒九香虫配方颗粒特征图谱中有5个共有峰,其中3个成分指认为犬尿喹啉酸(2号)、1,2-脱氢-N-乙酰基多巴胺(3号)、九香虫酰胺A(5号)。结论:所建立的方法操作简便、专属性和重复性好,准确度高,可用于炒九香虫配方颗粒的质量控制,为炒九香虫配方颗粒的质量标准制定提供实验参考。

九香虫提取物的抗疲劳和补肾壮阳活性评价

目的:评价九香虫提取物的抗疲劳和补肾壮阳活性.方法:以九香虫水提取物低、高剂量组(1.4,7.0 g·kg^(-1))小鼠灌胃给药15 d后,测定了小鼠的力竭游泳时间、血清尿素氮和血乳酸含量等.皮下注射氢化可的松建立了小鼠的肾阳虚模型,九香虫提取物低、高剂量组连续灌胃30 d,检测了小鼠胸腺、脾脏、肾上腺、睾丸、精囊腺等脏器系数,以及交配能力(捕捉潜伏期、捕捉率、交配潜伏期、交配率等).结果:九香虫提取物高剂量组能显著降低小鼠血清乳酸和尿素含量,延长力竭游泳时间,具有明显的抗疲劳作用.高剂量组还能显著增加肾阳虚小鼠的免疫器官、睾丸和附性器官的脏器系数,提高交配能力,具有明显的补肾壮阳作用.结论:九香虫提取物具有明显的抗疲劳和补肾壮阳作用.

九香虫含药血清对人结肠癌细胞SW480凋亡相关因子FADD·p53表达作用的研究

[目的]观察九香虫含药血清对人结肠癌细胞SW480增殖及凋亡相关因子FADD、p53表达的影响,初步探讨其诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制。[方法]20只雄性SD大鼠按随机数字表法分为2组(生理盐水对照组和九香虫含药血清组),每组10只。其中,九香虫含药血清组给予九香虫煎剂灌胃5 d后,制备九香虫含药血清,按不同浓度体外作用于SW480细胞72 h。CCK8细胞增殖试验检测其对SW480细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测其对SW480细胞凋亡的诱导作用,Western blot法、荧光定量PCR法检测细胞中FADD、p53蛋白及mRNA的表达。[结果]各浓度九香虫含药血清对SW480细胞生长均有抑制作用,且明显促进其凋亡,凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。Western bolt及荧光定量PCR结果表明,九香虫含药血清干预可使FADD表达明显增强,p53表达明显减弱。[结论]九香虫含药血清可诱导人结肠癌细胞凋亡,并影响凋亡相关因子p53、FADD的表达,从而达到抗肿瘤作用。

九香虫水提液对两种癌细胞的作用研究

本文研究九香虫水提取液对人胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞HepG2增殖抑制及细胞周期的影响。设置九香虫水提液药物组和正常对照组,应用倒置显微镜观察细胞形态;采用MTT法观察水提液对两种细胞的增殖抑制作用;利用流式细胞术分析其对两种细胞周期的影响。结果显示,九香虫水提液可使两种细胞变圆,脱壁细胞增多,细胞间空隙增大,细胞碎片增多;MTT实验显示,水提液能抑制SGC-7901细胞和HepG2细胞的体外增殖且呈明显的剂量依赖性,对SGC-7901细胞和HepG2细胞的IC50分别为154.24、129.46mg/L。流式细胞术结果显示,九香虫水提液使两种细胞的S期和G2/M期比例增加,G0/G1期细胞比例降低,表明九香虫水提取液能抑制SGC-7901和HepG2细胞的体外增殖,其机制可能是由于细胞周期的阻滞。

顶空固相微萃取-气质联用法分析九香虫的挥发物成分

分析九香虫(Aspongopus chinensis)挥发物的化学组成及各组分的相对含量,可为九香虫的开发利用提供科学依据。采用顶空固相微萃取(HS-SPME)法提取采自遵义正安九香虫的挥发物,用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对该挥发物进行分析鉴定,并采用面积归一法确定其各成分的相对含量。结果表明,九香虫挥发物共含有29种成分,其中醛类8种、烷类4种、酸类4种、烯酸类2种、酯类2种、醇类1种及胺类、呋喃类、吡唑类、吡啶类等化合物成分;而相对含量较高的是十三烷、十二烷、3-己烯酸和反-2-己烯醛,分别占总量的92.297%、2.712%、2.262%和0.564%。九香虫挥发物主要由烷类物质所构成。

九香虫对染锰雄性大鼠生殖损伤的保护

目的探讨九香虫对生殖系统损伤的雄性大鼠生殖功能的保护作用。方法将35只8周龄的雄性SD大鼠随机均分为5组,即模型组、空白组和九香虫高、中、低剂量干预组。除空白组外,其余大鼠给予腹腔注射15 mg/kg Mn Cl2·4H2O建立生殖损伤模型,九香虫组饲料含高、中、低剂量的九香虫,连续8周。观察和检测SD大鼠的生殖能力指标(性行为、大鼠精子数、睾丸和附睾的脏器系数、血清性激素水平)。结果模型组的扑捉次数,射精能力,和精子数量较空白组和九香虫中、低剂量干预组明显下降;模型组睾丸、附睾脏器系数均显著低于空白组和九香虫高剂量干预组;模型组血清中睾酮水平均低于空白组和九香虫干预组,而黄体生成素水平则高于空白组和九香虫中剂量干预组。结论中剂量的九香虫对生殖系统损伤的雄性大鼠生殖功能具有最佳保护功效果。

CCK-8法检测九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

为了明确九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用,本文利用Bradford法检测九香虫血淋巴浓度,用不同浓度的九香虫血淋巴处理体外培养的MCF-7细胞,采用CCK-8法检测九香虫血淋巴对MCF-7细胞的抑制作用。结果表明:九香虫血淋巴能显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长,且对MCF-7的抑制率呈时间、剂量依赖关系。

九香虫的营养成分分析与评价

对九香虫的粗蛋白、粗脂肪、氨基酸组成及含量,脂肪酸的组成及含量,VA、VE、VB1、VB2,微量元素Fe、Cu、Zn、Pb、Hg、As的含量,以及有机氯农药残留量等进行了测定。结果表明:九香虫含有44.3%粗蛋白质,由18种氨基酸组成,含量较多的氨基酸是丝氨酸20.40%、苏氨酸15.52%,而色氨酸和缬氨酸含量较低,分别是0.30%和0.70%;含粗脂肪53.0%,油脂中含有豆蔻酸(C14:0)、十四碳-烯酸(C14:1)、软脂酸(C16:0)、软脂油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、花生酸(C20:0)、二十二酸(C22:0)、芥酸(C22:1)、二十二碳二烯酸(C22:2)和二十四酸(C24:0)等12种脂酸,其中有6种不饱和脂酸,不饱和脂酸含量占总油脂的57.1%;含VA214.4mg/kg、而VE、VB1、VB2含量较少;含有Fe、Cu、Zn几种微量元素,有毒元素Pb的含量达4.0mg/kg;有机氯农药残留只有α-六六六被检出,含量较少。应用E/N,以及AAS和CS等方法对其营养进行评价,E%为42.38%,E/N为0.736,符合FAO/WHO提出的参考蛋白质的模式。

九香虫血淋巴的抗菌活性初步研究

为进一步更加科学地开发利用九香虫抑菌物质,采用直接离心法、匀浆法和浸提法3种方式提取九香虫血淋巴,并分别检测每一种提取法所得上清液、下层液体和沉淀物质的抑菌活性,并进行比较分析。结果表明,血淋巴原血对10种试验菌的抑菌圈直径均大于0.7 cm,对革兰氏阳性菌的抑菌活性(MIC=16)强于革兰氏阴性菌(MIC=8)。说明,九香虫血淋巴对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有明显的抑菌作用。匀浆和浸提得到的血淋巴上清液的抑菌活性均比直接离心提取到的血淋巴上清液抑菌活性低;沉淀物质的抑菌活性比下层液体高,但低于上清液的抑菌活性。

中药九香虫混淆品的调查及鉴定

目的调查中药九香虫的混淆品,并进行品种鉴定。方法通过对药材市场和主要产地调查,利用昆虫分类学方法进行品种鉴定,比较不同品种间的原动物和药材的形态学差异。结果累计调查并鉴定九香虫常见混淆品8种,均为性状相似的蝽科昆虫,并列出了鉴定检索表,总结其与九香虫的性状主要区别点。结论蝽类昆虫品种繁多,性状相似,常混作中药九香虫用,使用时应注意鉴别。

九香虫三氯甲烷浸提物对两种癌细胞增殖和周期的影响

目的研究九香虫三氯甲烷浸提物对胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。方法本研究采用冷浸法获得九香虫的三氯甲烷浸提物;MTT法分析三氯甲烷浸提物对两种癌细胞体外增殖的抑制作用;流式细胞术分析三氯甲烷浸提物对两种癌细胞的细胞周期的影响。结果九香虫三氯甲烷浸提物能抑制SGC-7901细胞和HepG2细胞的体外增殖并呈明显的剂量依赖性,IC50分别为1 193.52和964.34μg/mL;流式细胞术分析表明,三氯甲烷浸提物作用后HepG2细胞的S期和G2/M期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例明显升高。结论九香虫三氯甲烷浸提物能抑制两种肿瘤细胞的体外增殖,对HepG2细胞抗肿瘤活性可能是由于通过其细胞周期的阻滞引起。