人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论 所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂 (pLXHDmB7 2或LTB)。用免疫原免疫 3次 ,末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应 (DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液 ,进行脾细胞增殖试验 ,并进行CD4 + /CD8+ T细胞中IFN γ+ 或IL 4 + 细胞的FACS分析。结果 :与对照组相比 ,各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前 ;肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结 ,镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数 (SI)和CD8+ IFN γ+ 细胞数均高于鼻内滴注组 ;而鼻内滴注组CD4 + IL 4 + 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组 ;加入pLX HDmB7 2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论 :证实了重组pVAX1 HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应。同时 ,证实B7 2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应?

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。

人乳头瘤病毒18型主要衣壳蛋白原核表达系统的构建及鉴定

目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型(HPV18)主要衣壳蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒pBR322-HPV18为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1 DNA片段,将HPV18L1 DNA与pUC 19质粒重组构建pUC19-HPV18L1重组质粒;用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化;再利用pQE32质粒做表达载体构建重组质粒pQE32-HPV18L1,并用酶切电泳验证;利用SDS-PAGE检测HPV18L1目的蛋白;利用Western杂交鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性。结果PCR扩增DNA片段约为1.7kb,与预期结果相同;克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变;表达重组质粒pQE32-HPV18L1酶切图谱亦与预期相同;SDS-PAGE显示,约63×103处可见目的蛋白带,与预期结果一致;Western杂交鉴定,在Mr约63×103处可见目的条带,与预期结果一致。结论成功构建原核表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18主要衣核蛋白。

马源人乳头瘤病毒18型的鉴定及遗传进化分析

为了解新疆地区马携带病毒的多样性,本研究采集新疆昌吉市和伊宁市30匹纯血马,147匹本土马粪便、鼻拭子和血清样品,采用高通量测序检测马携带病毒多样性。结果显示马粪便携带人乳头瘤病毒18型(HPV18)。根据GenBank中HPV18参考株E6基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测。结果显示20%(6/30)纯血马粪便样品携带HPV18,与其同场饲养的本土马粪便样品HPV18阳性率为12.7%(7/55),非同场饲养的本土马粪便样品HPV18阴性(0/92),表明马源HPV18可能是由纯血马携带的病毒。此外,马鼻拭子和血清样品中未检测到HPV18,表明该病毒可能仅存在于马肠道中,这也是本研究首次在动物肠道中检测到HPV18。马源HPV18 E6基因核苷酸和氨基酸序列与国外HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为99.6%~100%、100%,与我国HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为94.6%~97.3%、91.8%~96.8%,与马乳头瘤病毒E6基因与氨基酸序列同源性为35.8%~40.1%、14.6%~24.6%。遗传进化分析显示马源HPV18与国外HPV18亲缘关系较近,而与马乳头瘤病毒处于不同分支,表明马源HPV18可能是由纯血马携带的外来病毒。本研究首次鉴定了马源HPV18并对其E6氨基酸进行遗传进化分析,为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。

深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础,具有重要的应用意义。

云南地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒18型LCR基因变异特征分析

研究云南地区人乳头瘤病毒18型LCR基因在宫颈癌组织中的变异特点,通过系统发生分析探讨HPV-18变异株的分子流行特征,并通过转录因子结合位点的预测分析LCR变异对病毒感染可能造成的影响。本研究提取了云南地区74例女性宫颈癌组织样本中的DNA,通过PCR、测序、序列比对,分析了9个HPV-18LCR完整DNA序列的基因变异信息,并用Mega 7.0软件使用邻接法进行进化分析,使用JASPAR数据库对可能的转录因子结合位点进行预测。HPV-18LCR序列中发现T7258A、C7529A、G7563A、A7567C、T7592C、A7670T、T7736G、C7764T、C7857T、A41G、C54T、A89C和T104C13个核苷酸点突变,其中最常见变异位点是T7592C,其次是C7857T,突变频率分别为100%和44.4%。9个HPV-18LCR完整DNA序列分属于4个HPV-18LCR变异体,进化树分析显示云南地区流行的HPV-18主要为A系变异体(8个A1亚系,1个A4亚系),HPV-18LCR中T7592C、C7857T变异位于转录因子TBP、HOXA5的结合区域内。云南地区宫颈癌组织中主要流行的HPV-18为A系变异体,T7592C、C7857T是HPV-18LCR中主要变异位点。

食管鳞癌组织中人乳头瘤病毒16、18型E6蛋白,P53,MDM2蛋白的表达及意义

目的 研究HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达及意义。方法 运用免疫组化SABC法 ,检测 30例食管鳞癌组织中HPVl6、18E6 ,P5 3,MDM2蛋白的表达。结果 30例食管鳞癌组织HPVl6、18E6蛋白检出 15例 ,阳性率为5 0 % ;P5 3蛋白检出 17例 ,阳性率为 5 6 .6 7% ;MDM2蛋白检出 6例 ,阳性率为 11.5 0 % ;HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白的检出与癌组织的分化程度密切相关。HPVl6、18E6蛋白和P5 3蛋白共同表达阳性 12例 ,占 4 0 % ,有显著相关性 (P <0 .0 1) ;MDM2蛋白和P5 3蛋白的表达无相关性。

RNA干扰沉默食管癌细胞株ECA109中人乳头瘤病毒18型E6、E7基因对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响

目的应用RNA干扰（RNAi）技术，使人乳头瘤病毒18型（HPVl8）E6、E7基因表达下调或缺失，观察下调或缺失后的HPVl8阳性食管癌细胞株ECAl09细胞内的人类白细胞抗原（HLA）-Ⅱ类分子表达。方法．将合成并包装好的含有E6、E7基因片段的短发卡RNA（shRNA）腺病毒载体（shpAd—E6-eGFP、shpAd—E7-eGFP）感染食管癌细胞株，并用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）[E6siRNA组HLA—IImRNA表达量是空白组的1．27倍，E7siRNA组HLA—IImRNA表达量是空白组的1．66倍（P〉0．05]和Westernblot技术[各组ACTIN蛋白条带灰度基本-致，shRNA—E6、shRNA—E7、无关序列和阴性对照组蛋白表达分别为0．5543、0．7246、0．4452、0．4365，siRNAE6、E7实验组灰度稍高于空白组（P〉0．05）及无关序列组]以β—actin为内参照，在基因和蛋白水平上检测E6、E7和胞内HLA-Ⅱ类分子的表达。结果2条含有E6、E7基因片段的shRNA腺病毒载体（shpAd—E6-eGFP、shpAd—E7-eGFP）能有效的抑制ECAl09细胞中HPVl8E6、E7的转录及表达，抑制率分别为92％和89％，细胞内HLA-11类分子的表达上调，分别是空转染组及无关序列组的1．27和1．66倍，无关序列组和空白对照组HPVl8E6、E7及HLA—II的mRNA和蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论HLA-Ⅱ类抗原表达的缺失可能与食管癌中的HPV感染及作用明显相关。

E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒16/18型阳性患者分流的可行性

目的探讨E6/E7 mRNA检测用于人乳头状瘤病毒61(HPV)16/18型阳性患者分流的可行性。方法选取HPV 16/18型阳性的200例患者作为研究对象。所有患者均进行E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查及阴道镜活检检查。以病理结果为金标准,评估E6/E7 mRNA检测、液基细胞学检查对HPV 16/18型感染者的高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)及以上病变的诊断效能。结果在200例HPV 16/18型感染者中,阴道镜活检HSIL及以上病变的检出率仅为29.5%(59/200)。共107例患者HPV E6/E7 mRNA阳性,56例患者液基细胞学阳性。HPV E6/E7 mRNA阳性者HSIL及以上病变检出率高于阴性者(P<0.05);随着宫颈病变病理级别的提高,HPV E6/E7 mRNA阳性率呈升高趋势(均P<0.05),但液基细胞学异常率差异无统计学意义(P>0.05)。HPV E6/E7 mRNA诊断HSIL及以上病变的灵敏度、特异度分别为86.44%、60.28%,液基细胞学的灵敏度、特异度分别为25.42%、70.92%,HPV E6/E7 mRNA的灵敏度高于液基细胞学(P<0.05)。结论E6/E7 mRNA检测对HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病变具有较好的诊断效能,或可用于患者的进一步分流,以降低阴道镜的转诊率。

利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性

目的建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法 ,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究。方法建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证。结果ZsGreen法的HPV16/18假病毒最佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性。结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究。

人乳头状瘤病毒16/18型在口腔疣状癌中的表达及意义

目的 研究人乳头状瘤病毒 16 /18型在口腔疣状癌中的表达状况 ,探讨其在口腔疣状癌发生发展中的生物学意义。方法 采用SP免疫组化和原位杂交方法分别检测 8例正常口腔粘膜、13例疣状癌、10例高分化鳞状细胞癌、10例低分化鳞癌组织中HPV16 /18E6蛋白和HPV16 /18DNA的表达。结果 ①疣状癌HPV16 /18E6蛋白及HPV16 /18DNA阳性表达率均为 6 9.2 % (9/13) ,E6蛋白平均染色强度高于高分化鳞状细胞癌和低分化鳞状细胞癌组 (P <0 .0 5 )。②免疫组化方法检测HPV16 /18E6蛋白与原位杂交方法检测HPV16 /18DNA结果有良好的一致性。结论 HPV16 /18型感染是口腔疣状癌的重要致病因子 ,与高分化鳞状细胞癌、低分化鳞状细胞癌组织相比 ,HPV16 /18型感染与疣状癌的关系更为密切。

信号诱导增殖相关蛋白1和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白在宫颈癌中的表达及临床意义

目的:探讨信号诱导增殖相关蛋白1(SIPA1)和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白(HPV16/18E6)在宫颈癌中的表达及其与临床病理之间的关系。方法:Western blot检测宫颈癌C33A、HT3、SiHa、HeLa和CaSki细胞株中HPV16/18E6和SIPA1蛋白表达;免疫组织化学Envi-sion法检测正常宫颈组织(40例)和宫颈癌组织(174例)石蜡标本中HPV16/18E6和SIPA1蛋白;分析SIPA1和HPV16/18E6相互之间及其与宫颈癌盆腔淋巴结转移之间的关系。结果:宫颈癌细胞系中SIPA1与HPV16/18E6表达呈负相关。SIPA1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中阳性率分别为87.5%和58.6%,差异有高度统计学意义(χ2=11.78,P=0.001);SIPA1蛋白在有和无盆腔淋巴结转移时阳性率分别为19.0%和71.2%,差异有高度统计学意义(χ2=21.45,P=0.000),且SIPA1阴性者发生淋巴结转移风险高于阳性者(OR=5.011,95%CI2.311～10.866,P<0.01)。HPV16/18E6在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的阳性率分别为30.0%和79.3%,差异有高度统计学意义(χ2=37.72,P=0.000);HPV16/18E6在有和无淋巴结转移时阳性率分别为97.6%和73.5%,差异有高度统计学意义(χ2=11.31,P=0.001),HPV16/18E6阳性者淋巴结转移风险高于阴性者(OR=14.794,95%CI1.960～111.634,P<0.01)。宫颈癌组织中SIPA1与HPV16/18E6蛋白呈负相关(r=-0.249,P<0.001)。结论:SIPA1蛋白表达与HPV感染有关,HPV16/18E6有抑制SIPA1表达的作用,SIPA1在抑制宫颈癌的淋巴结转移中发挥着重要作用,可作为宫颈癌盆腔淋巴结转移的早期预测因子。

子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型感染与子宫颈癌及癌前病变的关系

目的研究子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型(HPV16·18型)感染与子宫颈癌及癌前病变的关系。方法我院妇产科宫颈疾病筛查中心对2003年1月～2005年6月求诊的20至60岁的已婚妇女6025例进行宫颈疾病诊疗,应用Taqman荧光PCR法定性检测宫颈分泌物HPV16·18型DNA,然后对HPV16·18型DNA阳性的妇女行阴道镜检查及宫颈组织活检病理检查。结果3550例HPV16·18型DNA阳性,其中慢性宫颈炎2628例(74.1%),子宫颈癌前病变(CINⅠ～Ⅱ级)874例(24.6%),子宫颈癌(包括原位癌)48例(1.4%)。慢性宫颈炎HPV16·18型DNA含量为115±20,子宫颈癌前病变HPV16·18型DNA含量为323±15,子宫颈癌的HPV16·18型DNA含量为625±57。结论Taqman荧光PCR方法可作为检测子宫颈HPV16·18型感染的手段,且可作为宫颈癌前筛查除病理学之外较可靠的检查方法。

宫颈癌发病与人乳头状瘤病毒l6/18型感染的相关性

将宫颈癌患者治疗前的活检组织,包括子宫颈鳞癌(n=38),腺癌(n=43),使用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的HPVDNAPCR检测试剂盒及美国PE公司PCR扩增仪检测人乳头瘤病毒(HPV)l6/18型。81例宫颈癌中64例HPV为阳性,检出率为79.0%;子宫颈鳞癌HPV16型阳性20例(52.6%),HPV18型阳性8例(21.1%);子宫颈腺癌HPV16型阳性8例(18.6),HPV18型阳性28例(65.1%)。宫颈癌与HPV感染高度相关(P<0.05)。感染了HPVl8型较多向腺癌转化,感染了HPV16型较多向鳞癌转化。

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定

目的:制备人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)18型阳性的肿瘤疫苗,并观察其体外活性。方法:利用昆虫杆状病毒(简称Bac to Bac)表达系统,将HPV18L1基因重组入穿梭质粒pFastBac-Htb,构建HPV18L1-Htb,通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组,分离重组的Bacmid DNA,并转染Sf-9昆虫细胞进行表达;透射电镜观察病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的形成;用Ni-NTA系统纯化表达蛋白;以小鼠红细胞凝集试验鉴定蛋白生物活性。结果:收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测在相对分子质量大约63000处可出现一新生蛋白条带,Western blotting证实为HPV18L1蛋白;透射电镜观察证实L1蛋白可自我组装成VLP,且主要定位于细胞核;小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白在0.5～4ng/μl范围可介导小鼠红细胞凝集。结论:Bac to Bac表达系统可高效地制备HPVVLP,并具有体外生物学活性;Ni-NTA系统能高效简便地纯化带有6×His短肽的HPV18L1蛋白。

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒的特征分析

目的对人乳头瘤病毒18型(human papilloma virus 18,HPV18)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)进行特征分析。方法采用质谱技术分析HPV18 VLPs(重组大肠埃希菌表达系统表达L1蛋白,自组装成为VLPs)蛋白质一级结构,圆二色谱技术分析蛋白质二级结构,高效液相色谱、透射电镜和动态光散射技术分析蛋白质三级和四级结构;同时采用假病毒中和试验分析HPV18 VLPs的免疫原性,SDS-PAGE法分析样品纯度。结果HPV18 VLPs蛋白翻译后修饰主要包括氧化和去酰胺化,完整L1单体分子量约56000;二级结构中螺旋、折叠、转角、不规则卷曲的比例分别为8.4%、46.1%、18.5%、30.2%;颗粒纯度达99%以上,且形态饱满完整,大小均一,直径约60 nm。HPV18 VLPs诱导小鼠产生中和抗体滴度的几何均值达3000以上。HPV18 VLPs中完整L1单体含量达95%以上。结论HPV18 VLPs结构完整,颗粒大小均一,纯度高,免疫原性良好,本研究为宫颈癌疫苗安全性和有效性的评价奠定了基础。