香菇乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因le-pyrG的克隆

通过巢式简并PCR和基因组步行技术从香菇(Lentinula edodes)单核体中克隆到乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(orotidine-5’-monophosphate decarboxylase,OMPDC)的编码基因le-pyrG,长度为946bp。经生物信息学分析,香菇le-pyrG基因含有2个长度分别为67bp和51bp的内含子,该基因可以编码1个含有275个氨基酸残基的蛋白质序列,该序列经比对分析显示与裂褶菌(Schizophyllum commne)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)OMPDC序列的相同性分别为73%和70%,相似性分别为84%和83%。这是首次报道从栽培食用真菌中克隆出乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶编码基因的全序列。

三孢布拉氏霉乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因的PCR扩增与序列分析

根据对卷枝毛霉Mucor circinelloides、布氏须霉PPhycomyces blakesleeanu、雪白根霉Rhizopus niveu、少根根霉Rhizo pus arrhizus和微小根毛霉Rhizomucor pusillus的乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶基因核酸序列的同源性分析,在第3个外显子内根据卷枝毛霉基因序列设计1对引物,以三孢布拉氏霉Blakeslea trispora基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到1个长度约为500 bp的产物。经过同源性分析证明该产物为三孢布拉氏霉乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶基因片段。在此基础上,采用抑制性PCR扩增技术,进行染色体步行,分别克隆染色体上相邻的DNA片段,测定了基因的全序列,并对该序列进行了分析。结果表明:在外显子区域核酸序列与卷枝毛霉、少根根霉和微小根毛霉的同源率分别为82％,81％和79％。

乳清酸核苷单磷酸盐脱羧动力学同位素效应的理论研究（英文）

采用密度泛函(B3LYP)理论对乳清酸核苷单磷酸盐脱羧酶(ODCase)催化乳清酸核苷单磷酸盐(OMP)脱羧反应的动力学同位素效应进行了理论计算研究,重点讨论分析了水分子对整个催化脱羧反应的影响。本文建立了包含水分子和残基的新分子模型,并对所有分子模型进行结构全优化,获得了反应势垒。计算了N-1的^(15)N动力学同位素效应和C-6的^(13)C动力学同位素效应。计算结果显示:质子化水分子与羧基上的两个羰基氧原子的氢键长度对催化脱羧反应势垒有很大影响,并且计算得到的^(15)N和^(13)C动力学同位素效应与实验结果吻合较好。这些结果都对我们提出的乳清酸核苷单磷酸盐催化脱羧反应机理提供了有利依据。

过量尿嘧啶胁迫下pyrG对维持构巢曲霉胞内尿嘧啶稳定及正常产孢起关键作用

为减少DNA中尿嘧啶的掺入,细胞内尿嘧啶水平受到严格控制,但其机制尚不清楚.构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶PyrG催化乳清苷酸(OMP)转化为尿苷酸(UMP)的反应,本研究发现,在过量尿嘧啶存在的情况下,PyrG对维持细胞内较低尿嘧啶浓度具有重要作用.与野生菌株相比,过量尿嘧啶及其代谢物对乳清苷酸脱羧酶缺陷的pyrG89突变体具有更强的抑制作用,并能增强pyrG89突变体的有性发育.通过数字基因表达谱(DGE)分析pyrG89突变体和野生菌株对过量尿嘧啶的转录响应,发现尿嘧啶转录激活pyrG89突变体中有性发育相关的基因.HPLC定量分析显示,在过量尿嘧啶存在的情况下,pyrG89突变体胞内尿嘧啶水平是野生菌株的6.5倍.本研究的结果不仅为细胞内尿嘧啶循环及细胞对过量尿嘧啶的适应机制提供了新内容,还揭示了OMP脱羧酶对真菌生长发育存在潜在影响.

酿酒酵母中过表达URA 5及URA 3基因催化合成UMP的初步研究

为提高乳清酸到尿嘧啶核苷酸(UMP)的转化效率,利用PCR方法扩增酿酒酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因URA5,并将其连接到携带乳清苷酸脱羧酶基因URA3的表达载体pYX212中,构建了重组质粒pYX212-URA5,然后转化到酿酒酵母BJX12中进行表达,并进行转化乳清酸到UMP的初步研究。试验结果表明:pYX212-URA5/BJX12发酵培养40h后以32mmol/L乳清酸为底物催化产生UMP的量约为7mmol/L。明显高于同等条件下pYX212/BJX12的UMP产量2.7mmol/L和对照组野生型BJX12的UMP产量2.4mmol/L。