乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上，对其进行了酶切鉴定，并对该基因５′区进行克隆和序列分析，在核实序列正确后，构建了以其为调控序列，指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒，采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性，从而证实基因调控序列的功能正确性，可以用于转基因动物乳腺表达研究，同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．

乳清酸蛋白基因调控序列的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G-CSF载体的构建

乳清酸蛋白基因经亚克隆、酶切鉴定，并对该基因５′区进行克隆和序列分析，在核实序列正确后，构建了以其为调控序列、指导人Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表达质粒，以用于转基因动物乳腺表达研究。

连续3次缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人血清白蛋白杂合基因座

目的:构建人血清白蛋白(hSA)与小鼠乳清酸蛋白(mWAP)调控序列的杂合基因座。方法与结果:在pBR322载体上连入预先无痕连接的3对同源臂,利用基于Red同源重组系统的缺口修复(gap-repair)技术,分别对8kb的mWAP基因座3′调控区、16 kb的hSA基因组编码序列及13 kb的mWAP基因座5′调控区进行连续3次基因抓捕,最终将全长37 kb的乳蛋白杂合基因座构入pBR322载体;通过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,确定mWAP基因座中的编码序列被精确地置换为hSA的基因组编码序列。结论:构建了整合有mWAP-hSA杂合基因座的pBR322载体,为研究杂合基因座在乳腺中的表达效果及置换型基因座表达的可行性提供了数据。

连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达。方法:采用连续3步缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。

小鼠乳清酸蛋白启动区指导人促红细胞生成素在转基因小鼠乳腺的表达

以小鼠乳清酸蛋白基因 (mWAP)调控区与人促红细胞生成素基因 (hEPO)构建融合基因 ,经动物个体暂态表达方法确证hEPO可在乳腺特异表达后 ,用显微注射方法将融合基因导入小鼠受精卵 ,再将受精卵移植到假孕小鼠 ,获得 86只G0 代小鼠 ,经PCR Southernblot及Southernblot证实 ,有 5 8只整合阳性小鼠 ,整合率为 6 7% ,ELISAkit,dotELISA等方法检测小鼠39只 ,有 1 6只表达阳性 ,乳汁中人hEPO的表达量高于 1 5 μg/mL .

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用 PCR技术 ,从小鼠基因组中克隆了 1 .6 kb乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′上游调控序列 ,经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达 ,将此序列与报告基因 CAT融合 ,构建了 p WAP- CAT- poly A乳腺定位表达载体 ,脂质体包裹后 ,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后 1～ 1 0 d采奶 ,用 EL ISA检测乳汁中 CAT含量。结果表明 ,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达 ,表达水平在家兔分娩后 1～ 5

鞭虫乳清酸蛋白TtWAP-3的原核表达、纯化及其活性研究

目的克隆、原核表达人鞭虫(Trichuris trichiura)乳清酸蛋白TtWAP-3,分析其生物学活性。方法分别以鞭虫成虫前端及尾端cDNA为模板,通过PCR扩增TtWAP-3编码基因;将TtWAP-3编码基因克隆至原核表达载体pET32a-sumo,构建重组表达质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白并进行Ni-NTA亲和纯化和SUMO酶酶切,用发色底物法检测rTtWAP-3对蛋白酶的抑制活性。结果在成虫前端及尾端均成功克隆获得TtWAP-3编码基因序列,构建的原核表达重组质粒pET32a-sumo/TtWAP-3在大肠埃希菌表达rTtWAP-3,该蛋白对人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和人蛋白酶3(PR3)有抑制活性,其抑制人NE(20nmol/L)、人PR3(200nmol/L)50%活性的浓度分别约为2.25μmol/L和5.34μmol/L。结论成功获得原核表达的重组TtWAP-3,该蛋白对人NE及人PR3均有抑制作用,为研究TtWAP-3对宿主的免疫调节作用奠定了基础。

人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建

[目的]以小鼠基因组为模板克隆乳清酸蛋白(whey acidic protein gene,WAP)5′和3′调控区,并构建人乳铁蛋白(Human Lactoferrin,hLTF)乳腺特异性表达载体。[方法]以高保真PCR技术扩增WAP5′和WAP3′长度分别为3.5 kb和4.6 kb的DNA片段,并克隆测序,应用体外连接技术连接pcDNA3.0、WAP5′、WAP3′和hLTF,转化连接产物,以限制性内切酶酶切、PCR验证和琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。[结果]内切酶酶切及PCR鉴定结果显示,WAP5′和WAP3′基因克隆成功,其hLTF乳腺特异性表达载体构建正确。[结论]成功克隆WAP5′和WAP3′调控区;成功构建了hLTF乳腺特异性表达载体pW2-hLTF。

人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。

多个顺式作用元件调控t-PAcDNA乳腺定位表达

由牛 β-酪蛋白 ( β-Casein)启动子与大鼠乳清酸蛋白 ( WAP)启动子融合及串联构建成 2个组织纤溶酶原激活剂 ( t-PA) c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-βΔWAP-PA和 p SVL-WAPβ-PA。将这 2种表达质粒分别注入怀孕家兔乳腺导管中 ,溶圈试验结果显示 ,2种质粒均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 5天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 70 0 μg/ L和 50 0 μg/ L。本试验为进一步研究 t-PA基因乳腺定位表达调控和建立

融合启动子调控下的t-PA cDNA乳腺定位表达

由牛 β- Casein启动子与大鼠 WAP启动子融合构建了 t- PA c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-β△ WAP- PA,以研究 t- PA乳腺定位表达的调控。结果表明 ,将表达载体 p SVL- βb- PA,p SVL- WAP- PA及 p SVL-β△ WAP- PA分别直接注入怀孕的家兔乳腺管中 ,溶圈试验显示 3种表达载体均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 4天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 390 ,430和 6 70 ng/ m L。证明 0 .6 kb的牛 β- Casein上游调控序列具有一定的定位表达调控能力。融合启动子较单纯的 β- Casein或 WAP启动子调控下的 t- PA c

BLG-LAtPA和鼠WAP共注射提高LAtPA在转基因小鼠乳腺中的表达水平

为了提高长效组织纤溶酶原激活剂 (LAtPA)在转基因小鼠乳腺中的表达水平 ,将受控于羊 β 乳球蛋白(BLG)的LAtPA表达载体BLG LAtPA与小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因片段进行共注射 ,采用此方法建立的转基因小鼠 ,经PCR筛选和Southern印迹鉴定 ,获得 3只LAtPA和WAP共整合阳性鼠 ,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达 ,表达水平达到 10 μg/mL。

不同启动子调控下的t-PAcDNA乳腺定位表达

乳清酸蛋白 (WAP)和 β -酪蛋白 (β -Casein)是哺乳动物乳汁中的主要蛋白质 ,其基因 5′侧翼区常作为乳腺定位表达的调控序列。表达载体pSVL -WAP -tPA和pSVL - βb -tPA分别含 1.1kb的大鼠WAP启动子和 0 .6kb的牛β Casein启动子序列及t-PAcDNA。采用基因直接注射方法将 2种表达载体分别注入家兔乳腺中。溶圈试验结果显示 ,两种表达载体均能在兔乳腺细胞中得到表达 ,且以分娩后第 4天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 45 0ng·mL-1和390ng·mL-1。为进一步研究t-PA基因乳腺定位表达调控和建立t-PA乳腺生物反应器奠定了基础。

β-半乳糖苷酶基因在小鼠乳腺细胞表达的研究

构建了以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）５′区２．６ｋｂ为调控序列，指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒，采用直接注射质粒于乳腺的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性，证实ＷＡＰ基因调控序列的功能正确性，可以用于转基因动物乳腺表达研究，同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．

连续三步‘Gap-repair’构建小鼠WAP--人LF杂合基因座

为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座,我们采用了连续三步‘Gap-repair’的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAPBAC)上亚克隆了8kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从hLFBAC上亚克隆29kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列;第三步,从mWAPBAC上亚克隆12kb的mWAP基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约49kb的mWAP-hLF杂合基因座。经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的。这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。