miR-26b对人脱落乳牙牙髓干细胞及人脐带间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响

背景:microRNA-26b(miR-26b)对干细胞的多种功能具有重要的调节作用,但其对人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞生物学特性的影响尚不清楚。目的:探讨miR-26b对人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响。方法:培养及鉴定人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞;用miR-26 mimics(实验组)和miRNAs mimics对照(对照组)转染2种细胞,构建过表达模型用于后续实验。CCK-8法检测过表达miR-26b细胞的增殖能力;Transwell和划痕实验分析过表达miR-26b细胞的迁移能力;RT-qPCR法检测过表达miR-26b细胞成骨诱导后成骨标志物的表达。结果与结论:①转染miR-26b模拟物可提高2种细胞中miR-26b表达量,促进人脱落乳牙牙髓干细胞增殖,对人脐带间充质干细胞的扩增无明显影响;②相较于对照组,2种细胞过表达miR-26b后迁移能力增强;③miR-26b在2种细胞成骨分化过程中表达水平降低;④相较于对照组,2种细胞过表达miR-26b后,成骨相关基因骨钙素、骨桥素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平均下调。结果表明,过表达miR-26b能促进人脱落乳牙牙髓干细胞增殖、迁移,抑制其成骨分化;也促进人脐带间充质干细胞迁移,抑制其成骨分化,但对其增殖无明显影响。

高糖对乳牙牙髓干细胞生长及成骨分化能力的影响

目的探讨高糖对乳牙牙髓干细胞(SHED)生长及成骨分化能力的影响。方法从河南大学赛思口腔医院口腔颌面外科收集拔除的6~8岁无牙体牙髓牙周疾病的健康儿童的滞留乳牙,体外培养获得SHED,实验分为5.5 mmol·L^(-1)低糖组及25 mmol·L^(-1)高糖组。用细胞计数CCK-8试剂盒(CCK-8)检测两组细胞的增殖速度。分别用含两种不同糖浓度的成骨矿化液诱导21 d后,行茜素红染色实验,实时荧光定量PCR(QPCR)技术检测骨向分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)表达的差异。结果CCK-8检测结果显示,培养2~6 d时高糖组的OD值小于低糖组(P<0.05);成骨诱导后,高糖组的钙化结节数量少于低糖组,且高糖组的RUNX-2、ALP、OCN和OPN的相对表达量低于低糖组(P<0.05)。结论高糖抑制SHED的生长及成骨分化能力。

骨碎补总黄酮对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化的影响

目的初步探索不同浓度骨碎补总黄酮(total flavone of rhizoma drynariae)对乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth)增殖及成骨分化能力的影响。方法2020年3月—2021年8月黑龙江省医院检验科初步筛选出适宜浓度的RDTF,三代分离、培养SHEDs,通过流式细胞术及茜素红染色分别对细胞表面标志物和成骨分化潜能进行鉴定。实验分为4组(0时段为对照组,24、48、72 h组),每组设置3个复孔,采用不同浓度RDTF处理SHEDs后钙钴法染色,Western blot法检测其成骨相关蛋白表达情况。结果结果显示,所获取的细胞为具有成骨分化能力的SHEDs。与对照组相比,24、48、72 h内各浓度组均对SHEDs增殖无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05),12.5、25 mg/L RDTF组的Runt相关转录因子2(Runx2)及骨钙素(OCN)的蛋白表达均显著上调,其中25 mg/L RDTF组对Runx2表达的促进效果最明显(249.681±14.653),差异有统计学意义(F=102.7,P<0.001)。结论RDTF对SHEDs的增殖无显著影响,可促进SHEDs成骨分化。

乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体miRNA筛选研究

目的 分析乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体中miRNA差异表达谱。方法 原代提取乳牙牙髓干细胞,在矿化诱导培养基中进行分化。超速离心法提纯外泌体并进行鉴定;利用miRNA基因芯片检测分化前后的外泌体中miRNA的表达谱,验证差异表达的miRNA,预测其靶基因,进行GO分析和KEGG通路的功能分析。结果 在未分化和分化的乳牙牙髓干细胞的外泌体中共发现215个差异表达的miRNA,最相关的KEGG通路为FoxO、Ras和MAPK等信号通路。GO分析包括多细胞生物的发育和结构形态发生的调控。结论 乳牙牙髓干细胞分化前后的外泌体miRNA可能会参加调控成牙本质向分化过程,为牙髓修复提供了理论依据。

人脱落乳牙牙髓干细胞治疗非口腔疾病的研究进展

人脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)作为一类具有较强增殖能力且能够多向分化的牙源性干细胞,易于获取且符合伦理要求,在干细胞治疗中具有很大潜力。目前关于SHEDs在非口腔疾病中的治疗作用缺乏阐述,本文就SHEDs在神经系统、消化系统、心血管系统、泌尿系统、免疫系统、内分泌系统及呼吸系统疾病中的最新治疗进展做一综述,以期为SHEDs在非口腔疾病中的临床应用提供参考。

脱落乳牙牙髓干细胞在神经系统疾病的应用及研究进展

神经退行性疾病是一类以神经元退行性病变为主要特征的疾病,目前在全球范围内频发,尚无有效的治疗措施。乳牙牙髓干细胞来源于脱落乳牙的牙髓,起源于神经嵴,具有高度的成神经潜能,可治疗多种神经系统疾病。文章就脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)在神经系统疾病组织修复与再生中的应用及研究进展做一综述。

白藜芦醇促进人乳牙牙髓干细胞的增殖和成骨分化

背景:白藜芦醇是一种天然非黄酮类多酚化合物。研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗肿瘤等多种生物活性,并且能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,但其是否能调节乳牙牙髓干细胞的成骨分化尚不清楚。目的:研究白藜芦醇对人乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化能力的影响。方法:组织块法分离培养人乳牙牙髓干细胞,不同浓度的白藜芦醇处理成骨诱导的人乳牙牙髓干细胞,CCK-8检测细胞活性,茜素红染色检测矿化结节数量,RT-qPCR检测成骨相关基因的mRNA表达及Western blot检测Runt相关转录因子2的蛋白水平。结果与结论:①CCK-8检测结果显示,处理第3天时,较高浓度(20,40,80,100μmol/L)白藜芦醇显著抑制细胞增殖,因此,后续实验中选用1,5,10μmol/L白藜芦醇处理乳牙牙髓干细胞,检测其对成骨分化的作用;②与成骨诱导对照组相比,10μmol/L白藜芦醇组乳牙牙髓干细胞的矿化结节数量显著增多;③与成骨诱导对照组相比,10μmol/L白藜芦醇组乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2和骨钙素的mRNA表达量升高;④与成骨诱导对照组相比,白藜芦醇组乳牙牙髓干细胞的Runt相关转录因子2蛋白水平呈浓度依赖性增加;⑤结果表明,适宜浓度的白藜芦醇可提高人乳牙牙髓干细胞的增殖和成骨分化能力。

脱落乳牙牙髓干细胞在肝脏疾病中的应用与研究进展

脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)因增殖能力强、致癌风险低,具有较高的细胞分化能力和免疫抑制能力,成为组织工程和再生医学的主要关注领域。近年来,有关SHED在肝脏疾病中的疗效与安全性方面研究逐渐增多,本文集中对SHED在肝脏疾病中的应用与研究进展作一综述,以期为后续进一步临床推广提供参考。

人乳牙牙髓干细胞在干细胞治疗中的应用

乳牙牙髓干细胞(SHED)是牙源性干细胞的一种,属外胚间充质干细胞。作为一种理想的干细胞来源,SHED在干细胞治疗中有良好的应用前景。本文阐述了SHED的生物学特征及其在干细胞治疗中的优势,探讨了SHED在组织再生和修复中发挥的多向分化潜能、细胞分泌功能和免疫调节功能等方面的功能作用。此外,本文还介绍了SHED在各系统、器官疾病治疗中的临床应用,重点阐述了用SHED进行干细胞移植在牙髓—牙本质再生、颌骨再生、神经系统疾病治疗和免疫系统疾病治疗方面的研究进展。

TNF-α对人脱落乳牙牙髓干细胞促破骨细胞形成能力的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)促破骨细胞形成能力的影响。方法:通过酶消化法体外分离、培养处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞;建立SHED与破骨前体细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的间接共培养模型,在破骨诱导培养液中加入0、5、10、50、100 ng/m L不同浓度的TNF-α,通过实时定量RT-PCR和Western免疫印迹检测破骨相关基因及核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路相关基因的表达。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果:在10 ng/mL的TNF-α刺激下,PBMCs中破骨相关蛋白CTSK和TRAP的表达水平均显著增高。Western免疫印迹和实时定量RT-PCR检测结果显示,SHED胞质内p-IκBα和胞核内p65蛋白、基因的表达水平在10 ng/m L的TNF-α刺激下显著高于无TNF-α刺激组。结论:炎症细胞因子TNF-α通过NF-κB信号通路对SHED促破骨细胞形成能力具有调控作用。

转化生长因子β3联合肝素在人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用

目的:探讨转化生长因子β3(TGF-β3)诱导人乳牙牙髓干细胞(SHED)向成牙本质样细胞分化的能力。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,获得SHED;对体外培养的第3代SHED分别单独加入25 ng/mL的重组TGF-β3,或与肝素联合进行培养;通过Q-PCR和Western-blotting方法,分别观察SHED表达成牙本质细胞特异性标志物-牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因及其基因表达产物-牙本质涎蛋白(DSP)的情况;通过碱性磷酸酶(AKP)试剂盒检测SHED的AKP活性的改变;细胞爬片行免疫化学染色和茜素红染色。结果:SHED在诱导体系中生长状态良好。25 ng/mL TGF-β3联合10 U/mL肝素作用组的AKP活性明显增强,与TGF-β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01);TGF-β3联合肝素作用组的茜素红染色呈强阳性,Q-PCR和Western-blotting结果均显示,该组的DSPP表达在mRNA水平和蛋白质水平上均明显升高。结论:在TGF-β3与肝素联合作用的诱导下,可促进SHED分化为成牙本质样细胞。

载重组人血管内皮生长因子165的邻苯二酚壳聚糖促进乳牙牙髓干细胞血管形成的研究

目的:体外研究载重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF165)的邻苯二酚壳聚糖(catechol-chitosan,Cat-CS)支架材料对乳牙牙髓干细胞(stem cells from pulpof deciduous teeth,SHED)血管形成的影响,为其在年轻恒牙牙髓再生中的应用提供理论基础。方法:结合酶联合消化法和倒置贴壁法分离培养SHED。经细胞形态、碱性磷酸酶和茜素红染色对SHED进行鉴定,通过噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium,MTT)法检测和对比壳聚糖(chitosan,CS)及Cat-CS的生物相容性,HE染色及扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)检测细胞在CS及Cat-CS上的粘附,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)检测血管内皮细胞表面标记物CD31、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)的表达。结果:SHED具有较强的增殖能力,碱性磷酸酶及茜素红染色阳性;MTT结果显示CS及Cat-CS对细胞无明显毒性;HE染色及SEM观察结果显示相比于CS,Cat-CS更有利于细胞在孔径内的延伸以及在其表面的粘附;与空白对照组比较,CS及Cat-CS能促进SHED表达CD31、VEGFR2和VE-cadherin,Cat-CS与rhVEGF165复合后,这些基因的表达进一步增加(P<0.05)。结论:Cat-CS具有良好的生物相容性,可以作为牙髓再生良好的支架材料。

重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞

目的:构建重组转录因子hFOXA2和hPDX1慢病毒载体,转染乳牙牙髓干细胞,诱导其向胰岛素生成样细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。方法:酶消化法分离培养人牙髓干细胞(DPSCs),有限稀释法纯化培养,流式细胞术分析细胞表面标志,并进行体外多向分化诱导验证;构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,Lipofectamine2000转染293T细胞进行病毒包装,通过荧光细胞计数测定病毒感染效率和滴度;以最佳感染复数(MOI)感染牙髓干细胞,诱导其体外重编程为胰岛素生成样细胞,免疫荧光染色测定PDX1、FOXA2及胰岛素原表达,ELISA法检测胰岛素分泌情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:体外成功分离培养人DPSCs;细胞表面表达STRO-1(98.01%)、CDl46(98.51%)、CD34(99.54%)和CD45(24.08%)。体外成骨、成软骨、成脂肪诱导分化特异性染色阳性;成功构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,双酶切和测序鉴定与GenBank的序列完全符合;病毒包装效率分别为(96.15±0.17)%和(95.49±0.21)%,感染滴度约为1.80×108GTU/mL,最佳MOI为20;诱导后的细胞表达胰岛素原、FOXA2和PDX1,胰岛素分泌量为1.92μmol/L,较未诱导组和对照组均显著增高(P<0.01)。结论:DPSCs经重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1转染诱导,可启动细胞重编程机制,形成胰岛素生成样细胞,可作为糖尿病基因治疗的种子细胞。

改良富血小板血浆促进乳牙牙髓干细胞成骨分化作用研究

目的:体外研究改良富血小板血浆(modified platelet-rich plasma,mPRP)促进人乳牙牙髓干细胞成骨分化的作用。方法:以α-MEM作为基础培养基,分别加入1%、2%、5%、10%4种不同浓度mPRP或者10%胎牛血清(对照),对第4代SHED连续培养并诱导矿化,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性的变化,qRT-PCR方法检测细胞内RUNX2和骨钙素mRNA含量的改变。结果:不同浓度的mPRP均可以促进乳牙牙髓干细胞的ALP活性,且浓度为2%时A值最高;qRT-PCR检测显示2%mPRP可以上调乳牙牙髓干细胞内RUNX2及骨钙素mRNA的含量。结论:一定浓度的mPRP对乳牙牙髓干细胞的成骨分化具有一定的促进作用。

改良富血小板血浆促进乳牙牙髓干细胞增殖的最佳浓度

背景:课题组前期实验发现用液氮冻融激活的改良富血小板血浆可以促进骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞的增殖,且这种促增殖作用具有浓度特异性。目的:体外研究不同浓度的改良富血小板血浆对人乳牙牙髓干细胞增殖的影响。方法:利用全自动血细胞分离机制备血小板浓缩物,反复冻融法激活,获得改良富血小板血浆;以α-MEM作为基础培养基,分别加入体积分数为2%,5%,10%,20%4种不同浓度改良富血小板血浆或者体积分数10%胎牛血清进行培养,观察细胞增殖差异。结果与结论:不同浓度的改良富血小板血浆均能够促进乳牙牙髓干细胞增殖,体积分数2%改良富血小板血浆与体积分数10%胎牛血清促进乳牙牙髓干细胞增殖作用接近。提示体积分数2%改良富血小板血浆可以促进乳牙牙髓干细胞的增殖,有可能代替胎牛血清用于乳牙牙髓干细胞的体外扩增。

脱落乳牙牙髓干细胞的生物学特性

在乳恒牙交替过程中,乳牙不断脱落,即脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)获取容易,且SHED较骨髓间质干细胞和牙髓干细胞有更强的细胞增殖能力。SHED含有的成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β、结缔组织生长因子、神经生长因子、骨形态发生蛋白等促进SHED增殖。SHED可向成牙本质细胞、神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肝细胞向分化及诱导宿主细胞分化为成骨细胞,还有免疫调节和促进伤口愈合功能,是理想的骨组织工程和皮肤组织工程种子细胞。有鉴于此,SHED在治疗牙体缺失、骨缺损,神经系统疾病和免疫系统疾病,皮肤外伤和肝脏疾病方面有着广泛的应用前景。

小型猪乳牙牙髓干细胞体外分离培养及鉴定

目的体外分离培养小型猪乳牙牙髓干细胞,并对其进行生物学鉴定。方法采用滤纸片法挑取单克隆小型猪乳牙牙髓细胞,免疫组织化学染色检测,体外比较单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞向矿化组织、脂肪细胞、及神经细胞诱导分化能力。结果分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞呈集落状生长,克隆形成率2.74%。波形丝蛋白、间充质干细胞表面标志STRO-1染色阳性,神经干细胞特异性标志nestin染色阳性。矿化诱导结果显示单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞,均为Von-kossa染色阳性,ALP表达明显,两者无明著差异。单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞经IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松诱导3周后,可分化为脂肪细胞,两者成脂率均较低。单克隆乳牙牙髓干细胞向神经细胞诱导分化后免疫荧光鉴定β-tubulinIII表达阳性,STRO-1表达阴性。混合牙髓干细胞无明显神经元样细胞分化。结论单克隆分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞具有很强的克隆形成能力及多向分化潜能,其矿化能力与混合的乳牙牙髓干细胞无明显差异。

骨形态发生蛋白4在诱导人乳牙牙髓干细胞形成牙结构中的作用

目的：研究骨形态发生蛋白4（BMP4）在诱导人乳牙牙髓干细胞（SHED）形成牙结构中的作用。方法：分离、培养SHED,并通过组织重组、器官培养及组织形态学分析等方法,研究SHED的成牙潜能及BMP4在其中的作用;结果：体外培养的SHED具有分化能力,但并不能直接被有诱导成牙能力的牙上皮诱导成牙,然而在BMP4的作用下,鼠牙源性上皮能够诱导SHED形成牙结构。结论：BMP4能够协助鼠牙源性上皮诱导SHED分化为成牙本质细胞,并形成牙本质及牙髓腔结构。

CM-DiI体外标记人乳牙牙髓干细胞的可行性研究

目的:筛选CM-DiI用于人乳牙牙髓干细胞标记的最佳浓度,并对标记后细胞的生物学行为进行评价,为下一步细胞活体移植和体内示踪打下基础。方法:酶解组织块法培养人乳牙牙髓细胞并纯化,免疫组化鉴定细胞来源,进行细胞体外多向诱导分化能力实验。将第3代细胞分别使用浓度2mg/L、3mg/L及4mg/L的CM-DiI进行标记,比较标记后细胞乳酸脱氢酶释放率及细胞增殖情况,并观察经体外多次传代后细胞荧光的表达情况。结果:酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙髓细胞;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;细胞具有成脂、成骨及成牙本质等多向分化能力。3种标记物浓度均未对细胞乳酸脱氢酶释放及细胞增殖产生显著的不利影响;随体外多次传代,标记荧光强度逐渐减退。结论:CM-DiI操作简便、染色速度快,可有效的标记人乳牙牙髓干细胞,其中3mg/L的标记浓度细胞毒性极小,标记效率高,在体外多次传代后荧光信号仍能稳定表达。

人乳牙牙髓干细胞体外表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子的研究

目的研究人乳牙牙髓干细胞(SHED)表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的能力及规律,为进一步探讨SHED治疗帕金森病的作用机制提供依据。方法通过酶消化法体外分离培养人乳牙牙髓中的干细胞,当传代至第3代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal A和细胞因子进行神经球诱导培养,通过Real-Time PCR、免疫荧光和ELISA等方法,分别从mRNA和蛋白水平检测体外培养SHED和神经球中GDNF的表达。结果 Real-Time PCR检测结果显示,在mRNA水平,SHED和神经球中都有GDNF的表达。在蛋白水平,免疫荧光结果可见SHED和神经球中都有GDNF的表达;采用ELISA法在培养第3天的SHED培养液和神经球的培养上清中均可检测到GDNF,并随着时间的延长,培养液中GDNF浓度明显升高。结论 SHED具有表达和分泌GDNF的能力。