碱性蛋白酶水解乳清蛋白过敏原条件的优化

以碱性蛋白酶水解乳清蛋白过敏原,采用三因素二次旋转正交回归设计对水解反应的工艺参数pH值、水解温度(T)、酶和底物比(E︰S)进行了优化。建立了以乳清蛋白水解物的-αLA抑制率和-βLG抑制率为响应值的二次旋转正交回归模型。方程通过F检验t、检验和应用验证,模型较好地反映碱性蛋白酶水解乳清蛋白反应体系运行的规律。确定以水解物的-αLA抑制率和-βLG抑制率为响应值的最佳水解条件分别为:pH值为9.60,水解温度为50.4℃,E︰S为5153 U(每克蛋白质中)和pH值为8.46,水解温度为47.6℃,E︰S为5310 U(每克蛋白质中)。

乳碱性蛋白的功能特性及应用

乳碱性蛋白(MBP)为牛乳及人乳中痕量功能性物质的混合物,MBP直接作用于骨细胞,帮助骨形成并调节骨吸收。本文将概述了乳碱性蛋白的功能特性及其应用。

碱性蛋白酶限制性酶解乳清浓缩蛋白成胶特性的研究

研究了利用碱性蛋白酶限制性酶解乳清蛋白对其凝胶特性、成胶温度、凝胶粒径和蛋白组分水解情况的影响，结果表明，酶解可以提高乳清蛋白的凝胶特性，在酶解70min时达到最大值，此时乳清蛋白的水解度为7．22％，当酶解时间超过70min后随着水解时间的延长凝胶特性略有下降；各水解时间点乳清蛋白成胶温度均为80℃；酶解后乳清蛋白凝胶的粒径值下降了90％以上，且酶解30min后形成的凝胶粒径值都在50um以内；在碱性蛋白酶的限制性酶解作用下，仅部分β-乳球蛋白和很少部分牛血清白蛋白被酶解，而大部分α-乳白蛋白被酶解。

牛乳中具纤溶活性碱性蛋白酶的研究

通过ε-氨基己酸的解离作用,利用CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析、Lysine-Sepharose(赖氨酸-琼脂糖凝胶)亲和层析的方法,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定,从末乳中分离出一种具有纤溶活性的碱性蛋白酶。采用凝胶色谱和等电聚焦法对其分子量和等电点进行测定。结果表明:该蛋白酶为单体蛋白,纯化倍数2.11,分子量为47.0 ku,等电点7.8。纯化后酶的活性可完全被PMSF抑制剂抑制,属于丝氨酸蛋白酶家族。对酪蛋白具有一定的水解能力。

乳清蛋白与碱性电解质应用于运动保健固体饮料的研究

乳清蛋白含丰富的支链氨基酸和含硫氨基酸 ,将它与健力宝碱性电解质、复合碳水化合物、复合维生素、牛磺酸等配合经一次成型沸腾造粒技术 ,制成一种抗疲劳的运动保健固体饮料。该文从延缓肌原耗尽速度 ,清除能量代谢产生的乳酸 ,维护机体在运动过程中的正常代谢等三方面 ,论述了该饮料抗疲劳的理论基础 ,并用动物试验进行了验证。

乳清中乳碱性蛋白的分离与纯化

利用离子交换和葡聚糖凝胶层析等技术从制作干酪的副产物乳清中提取乳碱性蛋白。分别以洗脱速度、洗脱温度、洗脱液浓度为因素,进行L9(34)正交试验,最终得出各因素对离子交换树脂提取效果的影响主次顺序依次为洗脱速度>洗脱温度>洗脱液浓度;采用D072强酸性阳离子交换树脂提取乳碱性蛋白的最佳洗脱条件为洗脱速度2.50mL/min、洗脱温度40℃、洗脱液浓度0.04mol/L。在该条件下的乳碱性蛋白提取率为7.55%。在制得的粗MBP的基础上,利用SephadexG-100型葡聚糖凝胶,蛋白分离范围4000～150000D,对其进行纯化,测得最终纯度为83.55%。

乳碱性蛋白的生理学功能及应用

乳碱性蛋白(milk basic protein,MBP)是天然蛋白质中的一种组分,为乳清中的痕量成分,对增强骨质有特殊的作用。本文阐述了MBP的生理学功能及应用。

碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白工艺优化

目的降低乳清分离蛋白中的致敏蛋白含量,制备低致敏性乳制品。方法利用碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白,研究酶添加量、初始pH、酶解时间以及温度对乳清分离蛋白水解度的影响。在单因素的实验基础上,采用Box-Behnken实验设计方法进行四因素三水平的响应面优化实验。结果在P<0.05的水平下,4个因素对乳清分离蛋白的水解度都有显著影响。最优的水解工艺为:酶添加量6.4%、初始pH 11、酶解时间4 h、温度60℃。乳清分离蛋白在此条件下水解后,水解度达到21.11%。酶解液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示,经过这一优化工艺水解,10 kDa以上的蛋白基本全部被降解。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析酶解产物的多肽及蛋白质分子量分布,结果显示酶解产物的分子量大都分布在3.5 kDa及以下。采用间接竞争酶联免疫吸附法原理测定2种标志性致敏蛋白(β-乳球蛋白和α-乳白蛋白)的残余抗原性,发现2种致敏蛋白的残余抗原性也有不同程度的降低。结论通过碱性蛋白酶水解后,乳清分离蛋白中具有致敏性的大分子蛋白转变为小分子的肽类,从而降低了致敏性。

碱性氨基酸对β-乳球蛋白结构和致敏性的影响

碱性氨基酸是一种自身带正电荷的小分子,可与蛋白质上的负电残基发生静电吸引,也可与蛋白侧链上某些基团构成空间位阻,进而导致蛋白质结构的改变。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)可引发过敏反应,通过不同碱性氨基酸对β-Lg进行处理,研究其结构和致敏性的变化规律。以L-精氨酸(L-Arg)、L-赖氨酸(L-Lys)和L-组氨酸(L-His)单独或混合处理的β-Lg为研究对象,通过电泳、圆二色谱、光谱等技术分析其结构的变化;采用酶联免疫吸附法、细胞实验等方法评价其抗氧化活性、免疫球蛋白E(immune globulin E,IgE)/免疫球蛋白G(immune globulin G,IgG)结合能力和KU812细胞释放组胺和白介素-6的能力。结果表明,L-Arg、L-Lys和L-His处理β-Lg后,改变了β-Lg的二级结构、紫外吸收强度、内源荧光强度和表面疏水性,同时增加其ABTS阳离子自由基清除能力、降低IgE/IgG结合能力以及KU812细胞中组胺和白细胞介素-6的分泌能力。因此,L-Arg、L-Lys和L-His破坏β-Lg的构象过敏表位,降低其致敏性,顺序依次为L-His、L-Lys和L-Arg。研究结果为低致敏性牛乳制品的研发提供重要的理论指导。

碱性氨基酸修饰乳清蛋白基质凝胶功能性

将L-精氨酸(L-Arg)、L-赖氨酸(L-Lys)和L-组氨酸(L-His)分别加入到质量浓度为120 g/L的乳清蛋白溶液中,使每种氨基酸的最终质量浓度均分别为1、3和5 g/L,均质后再经90℃加热30 min制备热诱导凝胶,并探讨碱性氨基酸对凝胶功能的改造。通过物化、全质构、吸水性和凝胶电泳等分析手段,表征溶液的pH及其所成凝胶的形貌、质构、水化性质及凝胶内的蛋白浸出组分。结果表明,L-Arg、L-Lys及L-His均能明显提高蛋白成胶溶液的pH,蛋白都能形成颜色、形貌及"站立性"无明显差别的热诱导凝胶;L-Arg、L-Lys显著提高凝胶弹性、黏聚性、咀嚼性及回复性,降低凝胶硬度和胶黏性,而L-His除降低胶黏性外,对凝胶其他质构特性无显著影响。此外,它们对凝胶持水性提升幅度不大,但能够显著提高凝胶溶胀性,并有效抑制凝胶网络内蛋白浸出,促进蛋白凝胶网络结构的完整化。

瑰及乳膏对大鼠Ⅲ期压疮模型纤维结合蛋白及碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的本研究旨在探讨瑰及乳膏对压疮模型大鼠压疮肉芽组织中纤维粘连蛋白(fibonectin,FN)及碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,BFGF)水平的的影响机制。方法在128只SD大鼠中随机取32只设为假手术组,另96只均在大鼠双侧臀肌下埋置磁片外加磁铁片循环压迫缺血-再灌注的方法建立大鼠Ⅲ期压疮模型,4 d后随机分为模型组、阳性对照组及瑰及乳膏组。假手术组和模型组外敷生理盐水纱布,阳性对照组外敷水胶体敷料,瑰及乳膏组在压疮部位外敷瑰及乳膏纱布。在治疗结束时统计压疮创面显效时间、压疮愈合速度和愈合率,并分别于治疗的第3、7、14、21天时检测大鼠尾静脉血的血清炎症介质白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的水平,采用固相夹心法酶联免疫吸附实验检测压疮肉芽组织中FN及BFGF水平。结果瑰及乳膏组显效时间和愈合时间较阳性对照组缩短,创面愈合率和愈合速度较阳性对照组提高,两组比较差异有显著性(P<0.05)。在治疗第14、21、28天时,瑰及乳膏组静脉血CRP及IL-1β、IL-6均明显低于模型组和阳性对照组同期水平(P<0.05),BFGF及FN均明显高于模型组和阳性对照组同期水平(P<0.05)。结论瑰及乳膏可能通过抑制压疮创面炎症介质IL-6、IL-1β引起的炎症反应来减轻创面损伤,并提高BFGF及FN的合成来促进间质细胞的增殖和细胞外基质的合成,从而促进创面肉芽组织新生而加速创面组织修复。

初乳碱性蛋白制备工艺研究

以来自牛初乳的浓缩乳清蛋白粉为原料,柠檬酸钠为螯合剂、柠檬酸以及氢氧化钠为酸碱调节剂,用两步离心法去除α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,再用30 ku与1 ku膜分离获得初乳碱性蛋白。结果表明,乳清蛋白在37℃、pH值为3.9保温100 min和60℃、pH值为4.8保温80 min的条件下,蛋白质能分离56.7%;通过正交实验确定30 ku膜提取初乳碱性蛋白的条件为膜面流速为6.5 L/min,操作压力为0.5 MPa,循环次数为5次;再用1 ku膜以膜面流速为6.5 L/min,操作压力为0.8 MPa截留,去除小分子物质。整个分离提取获得浓缩乳清蛋白中初乳碱性蛋白占比为2.12%,为后续工业化生产提供参考。

中枢神经系统疾病患儿血清和脑脊液髓鞘碱性蛋白的定量分析

目的 探讨小儿中枢神经系统（ＣＮＳ） 疾病脑脊液（ＣＳＦ） 和血清髓鞘碱性蛋白（ ＭＢＰ） 水平的改变及临床意义，寻找反映小儿ＣＮＳ损伤的生化指标。方法 证实为ＣＮＳ疾病的患儿８５ 例，其中男５８ 例，女２７ 例，年龄１ 月～１３ 岁。采用ＥＬＩＳＡ 法对病例血清及部分病例ＣＳＦ标本作ＭＢＰ定量测定。结果 疾病组中ＣＮＳ感染、颅内出血、及颅内占位性病变等病例中ＣＳＦ和血清ＭＢＰ均值都明显高于正常对照组。结论 任何原因导致ＣＮＳ髓鞘结构的破坏时，其ＭＢＰ在ＣＳＦ的水平升高，当血清ＭＢＰ含量也升高时，提示血脑屏障（ＢＢＢ） 破坏，通透性升高。结果显示对ＣＳＦ和血清ＭＢＰ的检测，可作为一项反映ＣＮＳ损伤的生化指标。

乳清蛋白水解物抗氧化活性的研究

本实验主要研究了乳清蛋白的碱性蛋白酶水解产物在不同体系中的抗氧化活性。通过测定水解物对卵磷脂脂质氧化体系的硫代巴比妥酸值(TBARS)抑制作用、过氧化值(PV)的抑制作用、亚铁还原能力、金属离子螯合能力、DPPH自由基清除能力,研究乳清多肽的抗氧化活性。结果表明,底物浓度为5%、蛋白酶量的添加量为2%、水解时间为5h时乳清蛋白的水解物具有最强的抗氧化能力;碱性蛋白酶制备的乳清蛋白水解物的抗氧化能力与底物浓度、水解时间、溶解度等有关。

不同穴位电针对大鼠脊髓损伤植入脐血干细胞后生长相关蛋白-43、髓磷脂碱性蛋白表达的影响

目的探讨不同电针对大鼠脊髓损伤植入脐血干细胞后生长相关蛋白(GAP)-43、髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达的影响。方法将192只清洁级SD大鼠用NYU打击器采用Allen's法制成T10-11段脊髓损伤模型,造模成功后查随机表分为:①A组:运动区头皮表面投影区电刺激组,又分为A1组(电刺激+脐血干细胞移植)和A2组(只进行电刺激);②B组:损伤局部电刺激组,又分为B1组(电刺激+脐血干细胞移植)和B2组(只进行电刺激);③C组:运动区头皮表面投影区电刺激+局部电刺激组,又分为C1组(电刺激+脐血干细胞移植)和C2组(只进行电刺激);④D组:损伤模型组,以分为D1组(移植脐血干细胞不进行电刺激)和D2组(不移植不进行电刺激)。各组分别于1、2、3、4、8、12周时取材,采用生物素葡聚糖胺(BDA)皮质脊髓束顺行示踪,观察损伤区残存或再生的神经纤维的分布情况;通过免疫组织化学荧光染色检测GAP-43、MBP及MAB1281抗人核抗体的阳性表达。结果①NYU是一种用于Allen's法制备大鼠脊髓撞击损伤模型的撞击器,具有可使撞击势能量化的特点,获得的模型稳定、可重复性好、成功率高。②在本组研究各时间点上,电刺激对干细胞移植后微环境中GAP-43、MBP水平均有显著的正向干预作用,均较单纯电刺激有显著的正向协同干预作用,头针加体针的影响大于单纯头针或体针。③在本组研究各时间点上,电刺激对损伤后GAP-43、MBP水平均有显著的正向干预作用,不依赖于是否进行干细胞移植。结论①干细胞移植后,微环境的变化朝有利于神经功能恢复方向发展,说明干细胞移植能促进神经功能恢复以及本研究中干细胞移植成功。②电刺激对干细胞移植后微环境中GAP-43、MBP有显著的正向干预作用;头针加体针的影响优于单纯头针或体针;电刺激对损伤后微环境显著正向干预作用是独立的,不依赖于是否进行干细胞移植;电刺激与干细胞移植对微环境影响有显著的协同作用。

神经特异性烯醇化酶、碱性髓鞘蛋白评估重型脑损伤预后的研究

目的:研究重型脑损伤后血清神经特异性烯醇化酶(NSE),碱性髓鞘蛋白(MBP)浓度在预后的早期评估中的价值。方法:对2002-01/2002-12间40例重型脑损伤住院患者在伤后12h内进行血清NSE,MBP浓度检测,并结合格拉斯哥结局量表(GOS)评分进行比较分析。结果:40例重型脑损伤患者伤后血清NSE,MBP浓度均显著高于正常对照组,不同预后组之间NSE,MBP浓度存在显著差异。以伤后12h血清NSE浓度30mg/L,MBP10mg/L浓度为分界标准评估预后,NSE评估预后的特异度为77%,敏感度67%;MBP特异度为64%,敏感度61%。ROC曲线(受试者工作特性曲线)则显示NSE对预后的评估较MBP更敏感更特异。结论:伤后血清NSE,MBP浓度对评估预后具有较高的特异性和敏感性。而NSE浓度在预后评估中的作用较MBP更为敏感、特异,因此可作为评估重型脑损伤预后的一种可靠的临床方法。

苯及其同系物接触者血清神经特异性烯化酶及碱性蛋白水平变化

目的探讨苯及其同系物职业接触者血清神经特异性烯化酶(NSE)及髓鞘碱性蛋白(MBP)水平变化。方法采用酶联免疫吸附分析方法,对33例苯及同系物职业危害接触者(其中男性24例,女性9例)和26例正常对照者(其中男9例,女17例)进行血清NSE和MBP的测定。结果接触组血清NSE和MBP水平分别是(13.62±8.76)μg/L、(2.11±0.96)μg/L,显著高于对照组[NSE(8.86±4.49)μg/L、MBP(1.82±0.82)μg/L,P<0.05];接触组和对照组血清NSE异常水平总体概率分布分别为81.8%、15.4%,差异有显著性(P<0.05)。结论苯及同系物接触者血清NSE水平明显升高。

冷藏原料乳中荧光假单胞菌的分离鉴定及其产蛋白酶特性研究

【目的】对冷藏原料乳中易污染的嗜冷菌进行分离筛选，为提高乳品品质、控制乳品质量提供参考。【方法】从冷藏原料乳中筛选出1株嗜冷菌，通过形态学观察、生理生化试验、16S rDNA分子生物学分析，对该株嗜冷菌进行鉴定；并采用福林酚试剂法、蛋白酶定性检测试验、耐热性试验以及牛奶酸度、黏度影响等试验，对其产酶特性进行研究。【结果】从冷藏原料乳中分离出的该株嗜冷菌为革兰氏阴性短杆菌，与GenBank中登录的荧光假单胞菌的生理生化特征相符，二者同源性为92.5%～97.6%。对该菌产胞外酶能力的研究发现，该菌所产胞外酶为一种耐热碱性蛋白酶，最适温度为30 ℃，最适pH为8.0，可引起牛乳黏度增大、凝集和乳清析出。【结论】从冷藏原料乳中分离出了嗜冷荧光假单胞菌，该菌所产胞外碱性蛋白酶会引起牛乳黏度增加、凝集和乳清析出，明显缩短乳品的保质期。

不同神经损伤疾病血清髓鞘碱性蛋白测定临床价值探讨

目的 评价血清髓鞘碱性蛋白 (MBP)测定在神经损伤性疾病中的价值。 方法 采用酶免疫测定法定量测定神经损伤性疾病患者血清MBP水平。结果 血清MBP水平28例多发性硬化患者4.69±0.89μg/L,18例格林巴利综合征患者6.11±3.01μg/L,80例脑血管疾病患者5.03±2.33μg/L ,20例脑炎患者4.63±2.15μg/L ,52例脑挫伤患者5.67±3.14μg/L,24例2型糖尿病患者5.13±2.54μg/L,均显著高于对照组1.10±0.89μg/L(均P<0.01)。36例有CT或MRI检查异常的脑挫裂伤患者血清MBP水平 (6.68±3.08μg/L)显著高于无影像学改变者 (3.41±1.92μg/L) ;对36例脑挫裂伤患者动态观察表明血清MBP水平在创伤后12～36h升高。结论 血清MBP水平测定可反映神经损伤的范围和严重程度 ,可用于临床评估。

灌服碱性髓鞘蛋白对实验性变态反应性脑脊髓炎的抑制作用

从牛脊髓白质中提取碱性髓鞘蛋白（ＭＢＰ）免疫豚鼠建立实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）模型，并观察灌服ＭＢＰ对ＥＡＥ发病、临床症状、病理改变以及淋巴细胞体外增殖应答的影响。结果表明：用ＭＢＰ免疫豚鼠可产生典型的ＥＡＥ临床及病理表现；灌服ＭＢＰ组动物在发病、临床分级、病理改变等方面较对照组均有明显减轻，Ｔ－淋巴细胞对ＭＢＰ的反应受到明显的抑制。说明灌服ＭＢＰ可通过使Ｔ－淋巴细胞对ＭＢＰ产生特异性耐受而抑制ＥＡＥ的发生，提示灌服抗原诱导产生耐受的方法有可能作为免疫治疗自身免疫性疾病的途径之一。