橡胶树乳管特异性启动子连接HbHMGR1基因的易碎胚性愈伤组织转化

【目的】以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因（Hb HMGR1）乳管表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,获得抗性转基因材料,为研究Hb HMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础。【方法】用根癌农杆菌EHA105介导表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织,经卡那霉素筛选数月后,对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测。【结果】经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4~6个月筛选,得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系;取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定,均能扩增出与阳性对照相同的特异片段,uid A、NPTII和PHEV2.1-Hb HMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592 bp。2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定,发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带,而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带,包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列,其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列。【结论】将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中,可获得一个含35S-NPTII-PHEV2.1-Hb HMGR1-35S-uid A的转基因愈伤组织系。

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

【目的】克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(Hb HMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础。【方法】根据已报道的HEV2.1序列(Gen Bank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与Hb HMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定。【结果】用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852 bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%。将PHEV2.1与Hb HMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功。【结论】将PHEV2.1和Hb HMGR1基因先构建到p CAMBIA3301载体上再克隆至p CAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至p CAMBIA2301载体上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体p CAMBIA2301-PHEV2.1-Hb HMGR1。