橡胶树未授粉胚珠愈伤组织乳管细胞的鉴定及分化研究

乳管是橡胶树合成和贮存胶乳的场所。目前尚不清楚橡胶树未授粉胚珠来源的愈伤组织是否存在乳管细胞及其分化情况。本研究通过组织化学法、免疫组织化学法、分子生物学法证实未授粉胚珠愈伤组织中存在乳管细胞。RT-PCR结果显示,小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶延伸因子(REF)基因均能从未授粉胚珠愈伤组织cDNA中扩增出,Blast比对发现,它们的序列与已知的橡胶树树皮胶乳表达的基因序列相一致,进一步证实未授粉胚珠愈伤组织存在乳管细胞,且其功能与树皮乳管细胞相似。培养基中添加低浓度的茉莉酸(JA)能促进未授粉胚珠愈伤组织乳管细胞分化,而高浓度的JA会抑制其分化,JA浓度以1 mg/L效果最佳。橡胶树未授粉胚珠愈伤组织乳管细胞分化依赖于基因型。本研究结果为橡胶树未授粉胚珠愈伤组织可作为研究乳管分化机制的模型提供实验依据,对促进乳管分化机制研究具有一定意义。

茉莉酸甲酯对橡胶树花药愈伤乳管细胞分化的影响

橡胶树老化的愈伤组织存在乳管细胞。茉莉酸甲酯(MeJA)与茉莉酸(JA)同属茉莉酸类物质(JAs),但MeJA对橡胶树愈伤乳管细胞分化的效果尚不清楚。系统研究MeJA对橡胶树愈伤乳管细胞分化的效果,结果发现,低浓度的MeJA(0~1 mg/L)对花药愈伤组织的生长影响不明显,而高浓度的MeJA(2~3 mg/L)会抑制愈伤组织生长,且MeJA浓度与愈伤组织生长呈负相关关系。组织化学制片结果显示,低浓度的MeJA能显著提高愈伤乳管细胞发生频率,其中浓度为1 mg/L效果最佳;而高浓度的MeJA则会降低其发生频率。荧光定量PCR结果显示,培养基中添加MeJA后SRPP、REF、CPT等与橡胶生物合成相关的重要基因的表达量在愈伤组织中变化趋势与愈伤乳管细胞发生频率的变化趋势基本一致,进一步证实MeJA能促进愈伤乳管细胞分化。透射电镜观察发现愈伤乳管细胞内含有橡胶粒子、黄色体等细胞器。研究结果对促进橡胶树愈伤组织在乳管分化研究中的应用,以及开发新型橡胶树增产刺激剂,促进橡胶树天然橡胶的生产具有一定意义。

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。

巴西橡胶树乳管细胞HbWRKY1基因克隆及表达分析

采用PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆了WRKY转录因子家族的一个成员HbWRKY1。该基因全长为1755 bp,含有1个1440 bp阅读框,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,HbWRKY1含有2个WRKY结构域和C2H2锌指结构基序,与蓖麻、杨树、葡萄、黄瓜、拟南芥的WRKY成员的氨基酸序列同源性分别为64.14%、60.04%、42.54%、40.61%和35.4%,属于Ⅰ类WRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,割胶和乙烯显著上调HbWRKY1基因的表达,但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响,表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

【目的】克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考。【方法】采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系。【结果】从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77。二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体。HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体。qRT-PCR检测结果显示,HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性。经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达。在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异。HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达。【结论】HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记。

乙烯利刺激对橡胶树乳管细胞活性氧代谢的影响

研究了质量分数分别为1%,5%和10%的乙烯利刺激中龄橡胶无性系RRIM600,胶乳中活性氧产生速率及清除系统的变化。结果表明:高浓度乙烯利刺激后乳管中H2O2含量和活性氧产生速率提高,CAT,ASA-POD活性下降;而低浓度乙烯利刺激后乳管中H2O2含量和活性氧产生速率略有下降,CAT,ASA-POD活性则有不同程度的加强。

检测乳管细胞中黄色体产生O_2^-速率的研究

采用羟胺氧化法对橡胶树胶乳中黄色体产生Ｏ２－的速率进行研究，结果表明反应体系 中需加入一定浓度的Ｃａ２＋，并且也要控制适宜的温度与ｐＨ值。研究结果还表明，部分死皮 树胶乳中黄色体产生Ｏ２－的速度大于正常树。

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。

橡胶树乳管细胞中活性氧的产生与清除

论述了橡胶树乳管细胞内活性氧的产生系统。

巴西橡胶树HbHDR的原核表达及HbHDR在乳管细胞中的亚细胞定位

4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸还原酶(4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR)是异戊烯基焦磷酸合成途径之一甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径中的最后一个酶,催化4-羟基-3-甲基-(2E)-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸。根据笔者从橡胶树中克隆的HDR基因(命名为HbHDR,GenBank登录号:EU881977)序列,构建了HbHDR的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达获得融合表达蛋白。将融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备HbHDR的高效价特异的多克隆抗体。Western-blot分析表明,HbHDR存在于乳管细胞的橡胶粒子和C-乳清中。

茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。

橡胶树橡胶粒子起源的超微结构分析

【目的】橡胶树乳管细胞所富含的一种特征性细胞器是橡胶粒子,其主要功能是合成和贮存天然橡胶,但该细胞器的起源仍无定论。通过观察不同发育阶段乳管细胞的超微结构,比较分析橡胶粒子的发育与其他细胞器之间的关系,探明橡胶粒子的起源,为进一步认识橡胶粒子的功能奠定基础。【方法】利用透射电子显微镜技术,观察橡胶树萌条幼茎和成龄树树干的树皮中不同发育阶段的乳管细胞超微结构,分析最初的橡胶粒子与其他细胞器之间的关系。【结果】幼嫩萌条的初生乳管细胞的细胞质浓厚,可辨认的最初的橡胶粒子呈电子致密小球,主要分布在富含内质网和核糖体的区域。成龄树树干树皮形成层附近的幼嫩次生乳管细胞中,分布有大量的内质网和比较稀疏的橡胶粒子,其他细胞器的形态也较清晰,适合作为研究橡胶粒子起源的材料。在高倍放大的情况下,可观察到直径约50 nm、内部呈电子致密的球形小颗粒直接与内质网相连接,在内质网周围存在直径逐渐增大的有明显界膜的球形颗粒,并且这些颗粒的内部开始呈现电子透明,这些特征与橡胶粒子的发育相吻合。虽然高尔基体周缘也存在一些球形泡状结构,但这些小泡的内含物呈颗粒状,与最初形成的橡胶粒子明显不同。在充分发育的成熟乳管细胞中充满橡胶粒子,而树皮外侧的衰老乳管细胞开始出现橡胶粒子凝固,在这2种类型的乳管细胞中都很难分辨不同类型的细胞器,因此不适合作为研究橡胶粒子起源的材料。【结论】通过观察不同类型和不同发育阶段的乳管细胞超微结构可知,靠近形成层的幼嫩次生乳管细胞是研究橡胶粒子起源的最佳材料。在这一发育时期的乳管细胞中,可以清晰地观察到最幼嫩的橡胶粒子与内质网紧密相连,而与其他细胞器没有直接联系,因此本文结果支持橡胶粒子主要起源于内质网这一观点。该结果不仅可为橡胶粒子的起源提供直接的细胞学证据,而且为其他细胞器起源的研究提供借鉴。考虑到大、小橡胶粒子的膜蛋白和功能的差异,有必要利用胶体金电镜免疫细胞化学定位技术进一步研究大、小橡胶粒子的起源问题。

植物中活性氧的研究进展

为了增强对ROS功能的认识,增加对ROS在橡胶树死皮病中的作用以及对橡胶树高产分子机制的了解,本研究归纳了ROS产生和清除途径、影响其代谢的因子、ROS在植物中的功能以及ROS检测方法等,着重分析了橡胶树乳管细胞中的ROS产生和清除体系,指出线粒体也是乳管细胞中产生ROS的重要细胞器,并在最后做出展望。

强割和排胶过度引起的死皮是一种特殊的局部衰老病害

静态地比较不同病情的巴西橡胶死皮树胶乳的抗氧化剂和总酚含量、组织蛋白酶和酸性磷酸酶活性，黄色体破裂指数、胶乳和树皮组织的过氧化物酶活性。根据这些变化．提出巴西橡胶树由于割胶强度过大和排胶过度导致的生理性死皮，本质上是一种特殊的局部衰老病害。

巴西橡胶树HbCXE1基因克隆及其生物信息学分析

采用PCR和RACE技术从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆到一条CXE羧酸酯酶蛋白家族基因HbCXE1,该基因cDNA全长1272 bp,含有一个长951 bp的阅读框,编码含316个氨基酸的HbCXE1蛋白。生物信息学分析表明,HbCXE1蛋白理论分子量为35.5437 ku,理论等电点为5.94,HbCXE1蛋白与蓖麻、杨树、葡萄、苹果、拟南芥的CXE蛋白同源性分别为75.08%、62.81%、62.31%、59.43%、57.68%。HbCXE1蛋白具有羧酸酯酶蛋白家族的特征结构,有一个保守的催化基团,由分布于一级结构基序中的不同位置的3个保守氨基酸[丝氨酸(位于保守的G-X-S-X-G结构域中间)、天冬氨酸/谷氨酸、组氨酸]组成,一个保守的氧离子洞HGG结构域,有8个β-折叠结构,5个α-螺旋结构,因此HbCXE1蛋白属于羧酸酯酶蛋白家族,可能参与橡胶树乳管细胞的防卫反应。

过表达橡胶草糖转运蛋白TkSWEET1促进橡胶草的橡胶合成

橡胶草是产胶替代植物,其橡胶产量与库器官中的糖代谢过程密切相关,SWEET糖转运蛋白参与调控糖在库器官的分配。前期研究发现,TkSWEET1具有糖转运活性,并在橡胶草胶乳(乳管的细胞质)中表达量较高。本研究首先通过qPCR检测了TkSWEET1在橡胶草全生育期的时空表达特征,结果表明其在橡胶草中后期的根和胶乳中高表达。本研究还通过乳管特异表达基因(TkREF)的启动子过表达TkSWEET1。三个独立稳定转化株系中,TkSWEET1的表达量均显著高于野生型,但TkSWEET1-GFP融合蛋白并非乳管细胞特异。过表达TkSWEET1显著促进了根的伸长,并有增加根中胶含量和单株胶产量的趋势,而根部可溶性糖的含量、植株生物量并无显著影响。本研究为进一步探究橡胶草糖代谢对天然橡胶生物合成的影响提供参考。

巴西橡胶树HbTFIIB的克隆与表达分析

本研究采用RACE和RT-PCR方法,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆到转录复合体关键成员TFIIB的同源基因,命名为HbTFIIB。该基因全长1 472 bp,其中开放阅读框810 bp,编码一个由270个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为29.48 kDa,理论等电点为8.3。实时荧光定量PCR结果表明,HbTFIIB基因受割胶上调表达,而且在后期排出的胶乳中表达量显著高于前期排出的胶乳。Western blot分析表明,开割树胶乳中的HbTFIIB蛋白含量高于未开割树,而且在早期排出的胶乳中的含量明显高于后期排出的胶乳中的含量。本研究表明,割胶促进转录复合体蛋白基因表达和转录蛋白质合成,而且排胶会流失转录复合体蛋白。

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。