消化道酶类药物剂型研究——乳糖酶复合微囊

研制成功一种在胃和肠液中对酶类药物均具有保护作用的复合微囊剂型。方法是先将酶包埋,制成半透性微囊,再用肠溶材料将半透性微囊包埋。该复合微囊经口服进入肠道后释出半透性微囊,后者允许小分子底物自由通透,被膜内酶作用;而屏蔽肠道蛋白酶。将酵母乳糖酶制成复合微囊后,在人工胃液2h内可保留65％以上的剩余活性;在含胰酶人工肠液中6h内其活性也达60％以上。而游离乳糖酶在同样条件下很快失活。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

广东青少年乳糖酶缺乏状况研究

目的 研究广东省青少年乳糖酶缺乏和乳糖不耐受的发生状况。方法 采用不同剂量乳糖进行氢呼气试验。按广东省地理分布 ,选择广州、珠海、佛山、韶关等 4个城市的 7～ 1 8岁健康中小学生 1 1 0 0名 ,摄入 2 5g乳糖后氢呼气试验阳性 (乳糖酶缺乏 )的 81 1人中 ,随机选取乳糖酶缺乏的青少年进行牛奶氢呼气试验。结果 随着乳糖摄入量的减少 (2 5g、1 2 .5g、6 .2 5g) ,乳糖酶缺乏的检出率均大幅度下降 ,分别为 73 .7%、1 9.7%、7.2 % ;乳糖不耐受的检出率亦有随着乳糖摄入量的减少而降低的趋势 ,检出率分别为 32 .9%、4 .3 %、2 .1 %。结论 广东省青少年乳糖耐受量为 6 .2 5g ,每次饮用奶 1 2 5ml,92 .8%的饮用者可以消化吸收 。

5种瓜类植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达及活性测定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种富含亮氨酸重复单位的糖蛋白,能非竞争性地抑制真菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性,从而提高植物的抗病性。以黄瓜、苦瓜、冬瓜、节瓜和甜瓜幼苗为材料,研究PGIP的诱导表达特性及在不同组织中的含量差异。通过比较经孢子诱导、SA诱导和黑暗诱导的黄瓜幼苗中的PGIP的相对含量,发现经病原菌孢子悬浮液处理48 h时PGIP的表达量最高。对经孢子诱导48 h的黄瓜幼苗的根、茎、叶中的PGIP含量进行比较,发现茎中PGIP的相对含量最高。测定这5种瓜类的PGIP对6种尖孢镰刀菌粗PG的抑制作用,发现苦瓜PGIP的相对活性较高,并证实了不同的PGIP能够特异性地识别不同的PG,PGIP对不同PG存在着选择性抑制。

乳糖酶的应用及发展现状

对水解酶 β 半乳糖苷酶的酶源、特性、体内代谢作简要介绍 ,同时讨论了固定化技术、基因工程技术生产乳糖酶的发展现状。

耐热乳糖酶产生菌株的筛选及产酶条件试验

目的 :探讨耐热乳糖酶产生菌的筛选方法及其产酶条件。方法 :利用含有 X-gal平板培养基 ,于 6 0℃划线培养 ,筛选出耐热乳糖酶产生菌 ,并观测了培养温度、培养时间、培养基初始 p H及乳糖浓度对菌株生长及产酶条件的影响。结果 :筛选出含耐热乳糖酶菌株 ,该菌株的最适产酶条件分别为培养温度 (6 0± 1 )℃ ,培养时间 1 8～ 2 1 h,培养基起始 p H7.0～ 8.0 ,培养基乳糖浓度 41 .7mmol/ L。结论 :在含有 X-gal培养基进行划线培养是筛选产乳糖酶菌株的有效方法 ,同时该菌株具有嗜热性。

Paenibacillus sp.K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产-βgalactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillussp.K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18(lac-)为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2 028 bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21(DE3)中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06 U/mL,高于原始菌株的4.55 U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。

产乳糖酶酵母K luyveromyces fragilis株培养产酶发酵条件的优化

目的 :为进一步提高产乳糖酶酵母 Kluyveromyces fragilis(K.fragilis)株的酶产量 ,对该菌株的培养产酶发酵条件进行优化试验。方法 :采用增殖和诱导二步培养法培养酵母 K.fragilis株 ,并采用单因素试验方法分析碳源、氮源对酵母诱导产酶的影响。结果 :确定了 K .fragilis酵母株诱导培养的较佳配方 ,当乳糖浓度为 1 2 0 g/ L,醋酸铵浓度为 5 g/ L,p H为 6 .7时 ,单位酶产量达1 2 2 .4IU/ ml培养液。结论 :该菌株生长产酶情况良好 。

衰老相关β-半乳糖苷酶在老年大鼠肾脏组织中的变化及意义

【目的】研究大鼠肾脏组织随增龄衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性的变化规律，并探讨其与肾脏衰老的关系，以寻找可用于评判肾脏衰老的相关指标。【方法】留取3，12，24月龄Wistar大鼠肾脏（每组各6只）。采用PAS和Masson染色观察肾组织病理变化；β-gal染色观察大鼠肾组织SA-β-Gal活性的变化。【结果】随增龄，老年大鼠肾组织出现肾小球肥大，节段性肾小球硬化，局灶性肾小管萎缩、间质纤维化和炎性细胞浸润；肾脏病理评分显示肾小球和小管间质病变评分随增龄逐渐增高，24月龄组评分值显著高于3月龄和12月龄组（P〈0．05）。大鼠肾组织SA-β-gal染色阳性面积百分比随增龄逐渐升高，24月龄组阳性百分比显著高于3月和12月龄组（P〈0．05），并与同月龄组肾脏病理评分（肾小球和肾小管间质）呈正相关（r=0．585和0．612，P〈0．05）。【结论】随增龄大鼠肾组织SA-β-Gal表达逐渐增强，可能作为大鼠肾脏衰老的一项检测指标。

正常人成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化(英文)

背景:二倍体成纤维细胞常用于研究细胞水平的衰老,β-半乳糖苷酶是鉴别衰老细胞的标志酶,本实验拟观察正常人成纤维细胞在体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化情况。目的:建立一个稳定的二倍体成纤维细胞体外培养体系,了解正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,接种于培养皿中,细胞培养达80%汇合时进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③细胞生物学行为的观察对比:取生长状态良好的细胞,按群体倍增水平分为两组,第一组代表年轻细胞,采用10代龄;第二组代表老化细胞,采用65代龄。进行消化传代,分别按2×104,4×104分别接种于24孔培养板内。每隔24h消化计数,每次每组计数3孔,计算均值。共记数8d,以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制生长曲线并计算细胞的群体倍增时间。④β-半乳糖苷酶组化检测及阳性细胞的半定量分析:成纤维细胞每5n代龄(共13代)作细胞爬片,漂洗,加入SA-β-gal染色液,37℃孵育48h。在显微镜下观察计数,蓝染细胞为阳性细胞,每次随机挑选视野计数500个细胞,得到阳性细胞百分率。主要观察指标:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达。结果:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变:细胞生长曲线显示,老化细胞生长速度较年轻细胞明显减慢。年轻细胞最大增殖数约为47.3×105,对数生长期在3.0～6.0d,细胞倍增时间为2.18d。老化细胞最大增殖数各为8.5×104,对数生长期分别在4.0～7.5d,细胞群体倍增时间依次为3.86d。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达:与年轻细胞组(阳性细胞率=4%)相比,衰老细胞组中阳性细胞率(60%)大为增强。直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:在正常人成纤维细胞从年轻向老化发展的过程中,细胞群体倍增时间呈增高的趋势;与年轻细胞相比较(占4%),β-半乳糖苷酶的表达在老化细胞中显著增强(占60%),且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,可反应细胞的老化程度。本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为老年学及肿瘤生物学甚至组织工程学发展提供科学依据。

β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

β-半乳糖苷酶的研究进展β-半乳糖苷酶来源及作用机理。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)普遍存在于动物(幼小动物的肠中)、植物(杏、苹果等)及微生物(细菌、霉菌等)中,能够将乳糖水解为葡萄糖及半乳糖供生物体代谢使用。在生物体体内,β-半乳糖苷酶是由Lac Z基因编码翻译而成的蛋白质酶类,通过提取动物、植物及微生物中的乳糖酶蛋白。

肠道乳糖酶缺乏症

世界上大多数人群中存在乳糖酶缺乏，其缺乏与种族和遗传有关。乳糖酶缺乏临床可无症状或症状轻重不一。部分有症状的患者，摄入中等量的乳糖后，测不到乳糖吸收障碍的证据。诊断通常应用呼气氢试验。治疗方法是避免摄入过多的牛奶，使用乳糖替代品。

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体的构建与蛋白特性分析

目的构建嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体并分析其表达蛋白的特性和结构。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因并构建表达载体pMG36e-lacZ,并对构建后的表达载体进行鉴定和表达蛋白进行二维与三维结构分析。结果成功构建了嗜酸乳杆菌ATCC4356-lacZ基因表达载体并分析出了表达的β-半乳糖苷酶二维和三维结构图。结论表达载体的构建和蛋白特性与结构分析结果为后续的蛋白表达和酶生物学特性研究奠定了基础。

冠脉内导入重组β-半乳糖苷酶腺病毒的实验研究

目的 :研究经冠状动脉内导入重组 β-gal腺病毒后心肌的转染效率 ,证明冠脉内导入途径是否为重组基因导入心脏的有效的可行的途径。方法 :用定向克隆的方法构建重组 β -gal腺病毒载体 ,将 1 .53× 1 0 1 2 pfu重组 β-gal腺病毒经冠状动脉造影导管由左冠状动脉分别导入到 7只雄性Yorkshire猪心脏中 ,于术后 1周、2周、4周及 8周处死动物 ,取左右冠状动脉、3～ 5mm厚的不同部位的心肌及各实质脏器标本 ,经 1 .2 5 %戊二醛固定 2 0min ,用PBS洗涤 3次 ,在室温下用X -gal染液染色 1 6～ 2 4h ,脱水、石蜡包埋、切片及HE复染 ,光镜下计算出表达 β -gal的心肌细胞百分数即为转染效率。结果 :经冠状动脉内导入重组基因后 ,于术后 1周即有 β-gal表达 ,2周达高峰 ,心肌细胞的转染效率高达 45 .57% ,全层左冠状动脉壁、心肌间质中均有 β-gal表达 ,4周 β-gal表达下降 ,8周 β -gal恢复至对照组的基线水平。结论 :经冠状动脉内导入重组腺病毒 ,心肌细胞及冠脉壁重组基因表达效率高 。

乳杆菌乳糖酶的基因异源表达及酶学性质分析

采用简并引物PCR和TAIL-PCR方法,从乳杆菌Lactobacillussp.B164中克隆得到一个乳糖酶基因bg42-164。基因全长2 031 bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,预测分子量76 kDa,无信号肽序列。将bg42-164连接pET-30a(+)载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后可检测到乳糖酶活力。SDS-PAGE分析乳糖酶BG42-164的蛋白分子量为76 kDa,使用组氨酸标签亲和层析方法进行蛋白纯化,并对纯化的乳糖酶BG42-164进行了酶学性质分析。该酶最适反应温度为50℃,经50℃处理30 min后,剩余酶活力保留80%以上,pH6.0时该酶的水解活力最高。牛奶水解试验表明,乳糖酶BG42-164对乳糖的水解效果良好,5 mL牛奶中添加250 U酶蛋白,在50℃条件下2 h乳糖水解率为100%。该酶温度范围宽,乳糖水解效果好,为其在低乳糖奶生产中应用奠定了理论基础。

高温乳糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)的 β -半乳糖苷酶基因bgaB经克隆、测序后 ,转入大肠杆菌高效表达载体pET - 2 0 (b)中。重组菌在IPTG诱导下 ,表达出的重组蛋白比酶活量为 6 6 6U/mg ,比出发菌株高 5 0倍。

阔叶山麦冬总皂苷对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆及代谢产物的影响

目的:探讨阔叶山麦冬总皂苷(Liriope platyphylla total saponin,LPTS)对D-半乳糖所致衰老小鼠学习记忆和神经介质相关酶及代谢产物的影响。方法:90只昆明种小鼠随机分为9组:生理盐水(normal saline,NS)组,模型组,LPTS高(100 mg/kg)、中(50 mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组,舒血宁组,绞股蓝总苷组,西比灵组,维生素E组,除NS组外,其余各组每天腹腔注射80 mg/kg D-半乳糖生理盐水溶液,然后小鼠再给予相应的药物干预,连续给药造模42d后,分别检测相关衰老指标。结果:LPTS对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆障碍有一定的改善作用,并且可以显著促进衰老小鼠体质量增长,提高其胸腺系数和脾系数,降低血清丙二醛的含量,降低脑组织单胺氧化酶活性和脂褐质水平,提高血清超氧化物歧化酶活性,升高肝谷胱甘肽含量。结论:LPTS可改善学习记忆障碍,并且具有抗衰老的作用。

IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的序列分析(英文)

背景:IgA肾病发病机制迄今不明,目前研究证实IgA肾病患者IgA1分子铰链区β1,3-半乳糖基转移酶的活性降低引起IgA1分子O-糖基化异常是该病发生的重要途径。作者前期研究推测IgA肾病患者外周血B淋巴细胞β1,3-半乳糖基转移酶特性伴侣蛋白Cosmc表达降低可能是IgA肾病糖基化异常原因的中心环节。目的:检测IgA肾病患者β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的DNA序列,并与Gene Bank公布的序列比对。设计:病例-对照观察。单位:四川大学华西医院肾内科。对象:选择2005-11/2006-08四川大学华西医院肾内科收治的肾病患者37例,包括IgA肾病患者27例和非IgA肾病患者10例,另选择5例健康自愿者,所有观察对象均知情同意。方法:实验于四川大学生物治疗国家重点实验室完成。采集所有观察对象的肝素钠抗凝外周静脉血2mL,采用经典酚氯仿法提取外周血基因组DNA,应用紫外分光光度仪定量DNA的含量,应用聚合酶链反应扩增所有观察对象的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区,并对每个观察对象的聚合酶链反应产物进行直接测序,将所有测序结果分别与GeneBank公布序列一一进行比对。主要观察指标:β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区的聚合酶链式反应产物扩增结果及测序序列。结果:①Cosmc基因的编码区位于Cosmc基因的257-1213位,扩增后的Cosmc基因大小为1247bp。②IgA肾病患者、非IgA肾病患者以及健康自愿者之间的β1,3-半乳糖基转移酶特异性伴侣蛋白Cosmc基因编码区序列均一致,并与GeneBank公布的序列无差异。结论:未发现IgA肾病患者有Cosmc基因编码区序列异常,提示Cosmc基因编码区序列与IgA肾病IgA1分子的糖基化异常可能无关。

原子转移自由基聚合制备新型接枝聚α-D-吡喃半乳糖苷色谱固定相及其性能

以2-溴异丁酰溴为引发剂,CuCl/CuCl2/Me6TREN为催化体系,在室温条件下采用原子转移自由基聚合(ATRP)法将单体6-O-甲基丙烯酰基-1,2,3,4-双-O-亚异丙基-α-D-吡喃半乳糖苷(6-O-methacryloyl-1,2,3,4-di-O-isopropylidene-α-D-galactopyranose,MAIPGal)接枝到5μm大孔硅胶表面上,得到了新型接枝聚合物(pMAIPGal)色谱固定相.考察了单体的合成过程、分离性能以及乙腈、甲醇对溶质保留行为的影响,并采用红外光谱和元素分析对固定相进行了表征.经元素分析测得该聚合物填料的接枝链密度达0.818 mg/m2.在反相色谱模式下,该固定相可基线分离7种酚类化合物和4种胺类化合物.与C18反相柱相比,该合成柱的分离时间较短且分离效果较好.同时,流动相中有机溶剂的含量对酚类和胺类化合物的保留行为有较大的影响,随着流动相中有机溶剂含量的增加,该类化合物的保留减弱.实验结果表明,该填料具有良好的色谱性能.