自噬抑制剂3-MA对乳胞素抑制胃癌BGC-823细胞增殖的影响及其机制

目的探讨联合应用自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)和蛋白酶体抑制剂乳胞素(Lactacystin,LAC)对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响及其机制。方法体外培养BGC-823细胞,MTT法检测BGC-823细胞增殖率,Western印迹检测线粒体凋亡相关蛋白Cytochrome C以及内质网凋亡相关蛋白caspase-4表达水平。结果与对照组相比,蛋白酶体抑制剂LAC可以引起明显的BGC细胞增殖率的下降,联合应用3-MA可以增加其引起的细胞增殖率的下降,Western印迹结果显示LAC可以上调线粒体凋亡相关蛋白Cytochrome C以及内质网凋亡相关蛋白caspase-4表达水平,联合应用3-MA和LAC可以进一步引起表达水平的升高。结论自噬抑制剂3-MA可以增加LAC引起的细胞凋亡,通过线粒体和内质网凋亡信号通路。

雷沙吉兰对乳胞素诱导帕金森病大鼠神经的保护作用及机制

目的观察雷沙吉兰对乳胞素诱导帕金森病(PD)大鼠神经的保护作用及机制。方法 SD大鼠分为空白对照组、模型组、雷沙吉兰预治疗组和治疗组,通过立体定向注射乳胞素至模型大鼠左侧黑质部位诱导模型,进行行为学、组织病理学检测,PCR检测目的蛋白表达变化。结果模型大鼠在阿朴吗啡的诱导下,向右旋转;与空白对照组相比,其余各组大鼠脑组织切片中酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数显著减少,但预治疗组和治疗组中TH阳性细胞较多;PCR定量显示Lamp2A与热休克蛋白(HSP)70在治疗组与空白组间存在差异(P<0.05),而治疗组间无差异。结论雷沙吉兰可以抵抗乳胞素所致的神经损害,改善动物行为学及组织病理学表现,具有神经保护作用,其机制可能与促进Lamp2A及HSP 70表达,减少TH阳性细胞丢失相关。

乳胞素诱导大鼠致帕金森病的实验研究

目的应用蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin)构建帕金森病(PD)模型,从泛素-蛋白酶体功能角度探讨PD的发病机制。方法应用立体定向注射法在大鼠黑质致密部上方注射乳胞素;观察大鼠行为学改变及光镜下中脑组织学改变;免疫组化染色观察黑质细胞α-synuclein表达和酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数。结果注射乳胞素后大鼠逐渐出现运动迟缓、少动、震颤等行为学异常,阿朴吗啡诱导出向健侧旋转行为;3 w后黑质部TH阳性细胞减少,部分黑质细胞内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy小体。结论乳胞素对多巴胺能神经元有毒性作用,可导致蛋白聚集、包涵体形成,应用乳胞素可成功构建PD模型;蛋白酶体功能异常可能在PD的发病中发挥重要作用。

乳胞素联合卡铂对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用

目的:探讨蛋白酶体抑制剂乳胞素(LAC)对体外卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响,并阐明其作用机制。方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,采用0、2.5、5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1) LAC干预SKOV3细胞48h,5μmol·L^(-1) LAC干预SKOV3细胞0、24、48和72h;将细胞分为对照组(细胞不经药物干预)、LAC组(加入5μmol·L^(-1) LAC)、卡铂组(加入10、20、40及80μmol·L^(-1)卡铂)和LAC联合卡铂组(加入5μmol·L^(-1) LAC和10、20、40、80μmol·L^(-1)卡铂)。采用MTT法和流式细胞术(FCM)检测各组卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制率和凋亡率。结果:MTT检测,随着LAC作用时间的延长和浓度的升高,SKOV3细胞的增殖受到明显抑制,48h时LAC的半数抑制浓度(IC50)为5.36μmol·L^(-1);LAC联合卡铂组细胞的增殖抑制率较相同浓度卡铂组明显升高(P<0.05),卡铂的IC50由58.08μmol·L^(-1)下降至18.37μmol·L^(-1)。FCM检测,随着LAC作用时间的延长,SKOV3细胞凋亡率呈升高趋势;与卡铂组和LAC组比较,LAC联合卡铂组SKOV3细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论:LAC可有效抑制卵巢癌SKOV3细胞的体外增殖且能诱导其凋亡,并可以明显增强卡铂对卵巢癌SKOV3细胞株的增殖抑制作用。

乳胞素诱导帕金森病大鼠模型行为学及病理学观察

目的用乳胞素诱导SD大鼠建立帕金森病(Parkinson's Disease,PD)模型,并进行行为学及病理学观察。方法乳胞素/DMSO(8μg/2μL)定向注射模型组大鼠左侧脑黑质内,DMSO组注射DMSO。于手术后第6、13和20天采用阿朴吗啡旋转实验检测行为学改变,用免疫组织化学法检测脑组织切片,进行TH阳性细胞计数及观察α突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集情况。结果模型组中SD大鼠向右旋转速度大于7 r/min;脑组织切片中可见α-syn聚集。与对照组相比,模型大鼠脑组织切片中TH阳性细胞数显著减少(P<0.05),模型组第10天处死大鼠与第20天处死大鼠相比,TH阳性细胞数差异具有统计学意义(P<0.05)。结论乳胞素单侧黑质内注射可以诱导大鼠PD模型。

铁螯合剂对乳胞素引起的tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨铁螯合剂对蛋白酶体活性抑制引起的tau蛋白过度磷酸化的影响。方法对大鼠双侧海马同时注射乳胞素及侧脑室注射铁螯合剂去铁胺,分别进行蛋白酶体活性检测、免疫印迹、免疫组织化学实验,检测大鼠海马内tau蛋白的磷酸化改变情况。结果 (1)乳胞素引起蛋白酶体活性明显下降,而铁螯合剂可以部分逆转下降的蛋白酶体活性;(2)免疫印迹和免疫组化方法均显示,乳胞素降低了蛋白酶体活性下降引起的tau蛋白Ser-396位点过度磷酸化。结论铁螯合剂可以降低乳胞素引起的大鼠海马内tau蛋白过度磷酸化。

乳胞素对胶质瘤C6细胞体内增殖的抑制作用

目的:在体外实验蛋白酶体抑制剂乳胞素(LAC)可以抑制神经胶质瘤C6细胞增殖的基础上,进一步在裸鼠体内观察乳胞素对C6细胞增殖率的影响,探讨乳胞素抑制胶质瘤细胞增殖率的可能机制。方法:体外培养C6细胞,选择处于对数生长期的细胞接种于裸鼠背部皮下,连续7 d腹腔注射给予乳胞素,实验分为模型组(Model)、乳胞素0.5μg/20 g组、乳胞素1μg/20 g组及乳胞素5μg/20 g组,每组3只裸鼠,每天观察小鼠一般状态(饮食、大小便、毛色、活动情况等);测量与计算不同时间点肿瘤体积,RT-PCR方法检测各组细胞中Bax、bcl-2和caspase-3 mRNA表达水平。结果:与模型组比较,乳胞素0.5μg/20 g组、乳胞素1μg/20 g组和乳胞素5μg/20 g组肿瘤体积明显减小(P<0.05),Bax/bcl-2和caspase-3 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。不同浓度乳胞素组肿瘤体积无明显差异,不同浓度乳胞素组Bax/bcl-2 mRNA水平及caspase-3 mRNA水平无明显差异。结论:乳胞素在动物体内能明显抑制C6细胞的增殖率,其作用机制可能是增加C6细胞线粒体途径的凋亡发挥抑制其增殖的作用。

蛋白酶体抑制剂乳胞素对胶质母细胞瘤U87MG的抑制作用

目的目的探讨蛋白酶体抑制剂乳胞素对人胶质母细胞瘤U87MG的抑制作用。方法培养人胶质母细胞瘤U87MGM,分别以5、10、15μmol/L作用于细胞株。MTT法检测细胞存活率;bcl-2、Bax及caspase-3 mRNA水平用RT-PCR法检测;Rh123法检测线粒体膜电势;Hoechst33342检测细胞凋亡情况;U87MG细胞Bax及bcl-2的蛋白表达用Western印迹法检测。结果与未处理组相比对,U87MG细胞在实验组的存活率下降,bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达和线粒体膜电势均下降,caspase-3 mRNA表达水平上升。结论在体外条件下,乳胞素对胶质母细胞瘤U87MG细胞具有较强的抑制效应。

表没食子儿茶素没食子酸酯对乳胞素诱导PC12细胞损伤的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对乳胞素(lactacystin)诱导的PC12细胞损伤的影响。方法接种PC12细胞培养24h后分别给予干预。实验分为5组:正常对照组,10μmol/L乳胞素损伤组,不同浓度EGCG预处理组(终浓度5、10、50μmol/L)。分别用MTT比色法检测细胞活性,Hoechst33258染色观察凋亡时细胞核形态的变化,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。结果 5、10、50μmol/L EGCG对乳胞素诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用。与乳胞素损伤组[(61.22±1.02)%]比较,5、10、50μmol/L EGCG预处理组细胞活力明显上升,分别为(66.99±1.30)%、(66.67±0.65)%、(73.40±0.67)%。Hoechst33258染色发现乳胞素损伤组较多胞核出现固缩凝集,而EGCG预处理组则较少。FCM检测也提示EGCG预处理可降低细胞的凋亡率,正常对照组、乳胞素损伤组、EGCG预处理组(5、10、50μmol/L)分别为3.0%、60.4%、59.8%、57.5%和38.6%。结论 EGCG可减轻乳胞素诱导的PC12细胞损伤。

乳胞素对SD大鼠脑出血模型神经新生的影响及机制

目的探讨UPS抑制剂乳胞素（lactacystin）对SD大鼠脑出血模型神经新生的影响及机制。方法采用Ⅶ型胶原酶诱导SD大鼠脑出血模型,分为对照组（A组）,乳胞素处理组（B组）,每组各20只;造模成功后第1~7天B组腹腔注射1mg/（kg.d）的乳胞素,A组腹腔注射等剂量生理盐水。第3周断头处死SD大鼠,以组织化学方法结合灰度值半定量检测泛素-蛋白酶体系统活性表达,采用分光光度计测定法检测转录因子-核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）含量,利用抗Brdu单克隆抗体,显示纹状体区神经前体细胞增殖的能力。结果与A组比较,B组泛素-蛋白酶体系统活性明显下降,损毁侧纹状体内NF-κB含量含量明显减少,神经前体细胞增殖的能力增强（P〈0.01）。结论乳胞素有利于SD大鼠脑出血模型神经新生,其机制可能与抑制泛素-蛋白酶体,调控NF-κB含量,减少神经元凋亡,促进神经元新生有关。

蛋白酶体抑制剂乳胞素对大鼠黑质多巴胺能神经元氧化损伤的作用

目的:观察蛋白酶体抑制剂乳胞素对大鼠黑质多巴胺能神经元死亡和氧化损伤的作用,并探讨氧化损伤在蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元死亡中的作用。方法:将70只SD大鼠随机分为乳胞素组和生理盐水组,每组35只。将蛋白酶体抑制剂乳胞素立体定向注射入乳胞素组大鼠右侧黑质中,生理盐水组大鼠注射等体积的生理盐水。旷场实验检测2组大鼠的穿梭距离、下肢站立次数和总跑动时间,前肢使用不对称实验检测2组大鼠前肢使用不对称指数,阿扑吗啡诱导旋转实验检测2组大鼠旋转行为,微量酶标法检测2组大鼠中脑黑质中羟自由基、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、蛋白质羰基和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平,免疫组织化学染色检测2组大鼠黑质中酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性神经元毁损程度。结果:与生理盐水组比较,乳胞素组大鼠的穿梭距离、下肢站立次数和总跑动时间明显减少(P<0.05)。与生理盐水组比较,乳胞素组大鼠前肢使用不对称指数明显升高(P<0.05)。乳胞素组大鼠注射阿扑吗啡后出现恒向健侧旋转。给药7和21 d后,与生理盐水组比较,乳胞素组大鼠注射侧黑质中羟自由基、MDA、蛋白质羰基和8-OHdG水平明显升高(P<0.05),GSH水平明显降低(P<0.05)。给药21 d后,乳胞素组大鼠注射侧黑质中TH免疫阳性神经元显著丧失。与生理盐水组比较,乳胞素组大鼠黑质中TH免疫阳性神经元残存率明显降低(P<0.05)。结论:大鼠黑质内注射蛋白酶体抑制剂乳胞素能够诱导大鼠黑质多巴胺能神经元氧化损伤,并最终导致神经元死亡。

乳胞素诱导食蟹猴慢性帕金森模型的初步建立

目的探索通过脑室内注射蛋白酶体抑制剂乳胞素的方法建立帕金森病(PD)食蟹猴动物模型。方法选取老龄健康雄性食蟹猴3只,随机分为实验猴2只(A猴、B猴)、对照猴1只(C猴)。实验猴多次重复脑室内注射乳胞素,对照猴注射同等剂量的0.9%氯化钠溶液。于给药前后60 min观察其行为学变化。采用免疫组织化学方法染色和行为学评分对模型进行验证。结果行为学观察结果示,实验猴出现类似PD典型的手臂震颤、运动迟缓、运动量减少等行为学改变;行为学评分与对照猴相比,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果示,实验猴酪氨酸羟化酶(TH)阳性面积较对照猴减少,差异有统计学意义(P<0.05);实验猴平均吸光度较对照猴减少,差异有统计学意义(P<0.05)。实验猴α-突触核蛋白(α-syn)阳性面积较对照猴增加,差异有统计学意义(P<0.05);实验猴平均吸光度较对照猴增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论该实验采用小剂量、多次重复脑室内注射蛋白酶体抑制剂乳胞素方式产生了类似PD的行为学改变,免疫组化结果显示黑质存在PD样病变,可认为已建立食蟹猴慢性PD模型,该模型能够较好地模拟PD患者的临床症状和病理进程。

蛋白酶体抑制剂乳胞素(LAC)对LPS诱导的人关节软骨细胞炎症反应的抑制作用

目的:探讨蛋白酶体抑制剂乳胞素(LAC)对LPS诱导的人关节软骨细胞炎症反应的抑制作用。方法:体外培养原代人关节软骨细胞,分为四组,即对照组、LPS组(100 ng/mL LPS处理6小时)、LAC组(5μM LAC处理1小时)和LAC+LPS组(5μMLAC预处理1小时后,给予LPS处理6小时),分别用ELISA和western blot检测和比较各组细胞内20s蛋白酶体,NF-κB,TNF-α和iNOS的含量。结果:LPS处理后的人关节软骨细胞内20s蛋白酶体,NF-κB,TNF-α和iNOS的表达均较对照组显著升高(P<0.05),LAC+LPS组以上指标较LPS组均显著降低(P<0.05),而LAC组和LAC+LPS组以上指标与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论:LAC可显著抑制LPS诱导的人关节软骨细胞炎症反应。

乳胞素诱导前列腺癌细胞凋亡机制的初步研究

目的探讨乳胞素在诱导前列腺癌细胞凋亡作用中与核转录因子（NF）-κB活性的关系。方法利用乳胞素作用两种前列腺癌细胞，设立培养液处理的空白对照组和乳胞素处理组，乳胞素处理组分别向两种细胞中加入浓度递增的乳胞素（0．5、1．0、2．0、4．0μmol/L），作用时间分别为8、16和24h。MTT法检测细胞生存率，利用酶联免疫吸附试验定量分析NF-κB DNA结合活性，Western blot法检测NF-κB p65核蛋白表达，酶分析法测定caspase-3活性。结果DU145细胞基础状态下NF-κB DNA结合活性强于LNCaP细胞（t=4．728，P=0．001），应用乳胞素作用24h后，与空白对照组比较，不同浓度乳胞素处理组均观察到NF—κB DNA结合活性减少。随着乳胞素浓度增加，LNCaP细胞NF-κB p65核蛋白表达水平下调，而DU145细胞NF-κB p65核蛋白表达水平没有变化。DU145细胞基础状态下caspase-3活性强于LNCaP细胞（t=4．519，P=0．001），乳胞素作用24h后，DU145和LNCaP细胞caspase-3活性均随乳胞素浓度增加升高（2．0μmol／L乳胞素处理组与1．0μmol／L乳胞素处理组比较，DU145细胞P=0．000，LNCaP细胞P=0．000）。结论乳胞素对不同前列腺癌细胞有不同杀伤作用，并与抑制NF-κB活性促进前列腺癌细胞凋亡相关，对激素非依赖性前列腺癌细胞还可能存在其他抗肿瘤细胞生存途径。

β-内酯类蛋白酶体抑制剂乳胞素及其衍生物的合成研究进展（英文）

当硼替佐米和卡非佐米被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤后,20S蛋白酶体已经作为靶点引起了关注,但这两种药物存在耐药性。作为第二代候选药物,从天然产物中提取得到的β-内酯类蛋白酶抑制剂被用于癌症、关节炎、哮喘和阿尔茨海默病的治疗,代表药物为Salinosporamide A(1)。本文综述了具有β-内酯结构的乳胞素及其衍生物的合成方法。

[^18F]FP-（＋）-DTBZ PET显像研究乳胞素诱导的帕金森病鼠模型

[摘要]目的乳胞素可用于帕金森病（PD）鼠模型的构建，构建的鼠模型脑细胞中可表达由α-突触核蛋白组成的路易小体。该研究通过PET显像评价2型囊泡单胺转运体（VMAT2）靶向显像剂[^18F]9-氟丙基-（＋）-二氢丁苯那嗪（[^18F]FP-（＋）-DTBZ）在乳胞素构建的PD鼠模型脑中的摄取。

蛋白酶体活性抑制对大鼠海马tau蛋白的泛素化影响

目的:探讨蛋白酶体活性抑制对大鼠海马tau蛋白的泛素化影响。方法:利用双侧海马注射蛋白酶体的特异性抑制剂——乳胞素分别进行蛋白酶体活性检测、免疫印迹、免疫共沉淀,以检测大鼠海马内tau蛋白的泛素化改变情况。结果:(1)乳胞素引起蛋白酶体活性在24和48h较对照组明显下降;(2)免疫共沉淀结果显示,蛋白酶体活性抑制使tau蛋白发生了异常泛素化。结论:乳胞素抑制了蛋白酶体活性并导致了大鼠海马tau蛋白的异常泛素化。

DMT1在多巴胺能神经元变性中的作用研究

目的:研究二价金属离子转运蛋白1(DMT1)在乳胞素(lactacystin)诱导的SH-SY5Y细胞中的表达改变,从而进一步了解DMT1在帕金森病(PD)神经元损伤中的可能作用机制。方法:建立lactacystin损伤的SH-SY5Y细胞模型,用免疫荧光、Western blotting等方法检测细胞DMT1表达水平的变化;在高亚铁环境下,荧光探针DCFH-DA检测胞内氧化应激水平的变化,免疫组织化学法、Western blotting检测胞内α-突触核蛋白(α-SYN)聚合体的改变。结果:Lactacystin处理后,细胞活力呈浓度依赖性降低。与正常对照组相比,lactacystin处理组DMT1表达增加(P<0.01)。正常对照组、lactacystin处理组及Fe2+处理组3组比较,其细胞活力逐渐降低,胞内氧化应激反应逐渐增强,胞浆α-SYN低聚体(43-55 kD)表达量逐渐增多(P<0.05)。结论:Lactacystin诱导SH-SY5Y细胞高表达DMT1,增强细胞摄铁能力,这可能是铁直接或者通过氧化应激反应促进胞内α-SYN的错误折叠和聚集、最终导致PD神经元损伤的关键因素。

基于泛素-蛋白酶体系统探讨远志散改善快速老化小鼠学习记忆能力的作用机制

目的:探讨远志散调控泛素-蛋白酶体系统(UPS)改善快速老化小鼠(SAMP8)学习记忆能力的作用机制。方法:以PC12细胞为载体观察乳胞素(LAC)对26s蛋白酶体(26s PS)的抑制作用,以6只C57BL/6J小鼠为对象观察双侧海马注射LAC的安全性。18只SAMP8小鼠随机分为模型(MOD)组、盐酸多奈哌齐(DON)组、远志散(YZP)组,12只SAMP8小鼠予双侧海马注射LAC后随机分为乳胞素(LAC)组、乳胞素+远志散(LAC+YZP)组,6只抗快速老化小鼠(SAMR1)为正常对照(CON)组,各组给予相应药物连续灌胃8周。Morris水迷宫实验评价小鼠的学习及记忆能力,HE染色检测海马病理学改变,透射电镜检测海马神经元超微结构变化,Western blot检测海马Ubiquitin、UBE3A、26s PS、UCH-L1、Tau5、pT231-Tau蛋白表达。结果:与MOD组比较,YZP组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05),海马组织病理形态及神经元超微结构病变有所改善,Ubiquitin蛋白表达水平显著下降(P<0.01),UBE3A、26s PS、UCH-L1蛋白表达水平显著升高(P<0.01),pT231-Tau蛋白表达显著下降(P<0.05);与MOD组比较,LAC组小鼠26s PS蛋白表达水平显著下降(P<0.01),pT231-Tau蛋白表达升高(P<0.05);与LAC组比较,LAC+YZP组pT231-Tau蛋白表达下降(P<0.05)。结论:远志散可提高SAMP8小鼠学习和记忆能力,改善海马组织及神经元超微结构病理变化,抑制磷酸化Tau蛋白异常沉积,可能与其调控UPS途径的关键靶点有关。