Hopx报告基因小鼠谱系示踪乳腺干细胞

背景:乳腺干细胞对于乳腺组织的发育和稳态维持十分重要。乳腺癌的发生与乳腺干细胞有着紧密联系。最新研究表明,Hopx作为形态发生和细胞分化的重要转录调节因子已被证实在神经、肠道、毛囊等多种成体干细胞中表达,然而其在乳腺中的作用至今尚未见报道。目的:探究Hopx是否可以作为乳腺干细胞的特异性标志物。方法:①选取8周龄雌性Hopx-LacZ转基因小鼠,利用β-半乳糖苷酶染色检测Hopx在乳腺组织中的本底表达情况。②选取4周龄、6周龄、8周龄及妊娠14.5 d的雌性野生型小鼠,分别进行乳腺全组织洋红染色及K14、K8免疫荧光染色。③选取8周龄与妊娠17.5 d的雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠,进行乳腺β-半乳糖苷酶染色。④选取4周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次,注射3次)来激活Cre/loxp系统,注射后4周进行乳腺β-半乳糖苷酶染色;选取8周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次,注射3次)来激活Cre/loxp系统,末次注射后4,10周进行乳腺β-半乳糖苷酶染色。⑤选取8周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次,注射3次)来激活Cre/loxp系统,注射后2周使Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠怀孕,对第1次妊娠17.5 d、第3次妊娠17.5 d的小鼠乳腺组织进行β-半乳糖苷酶染色。结果与结论:①β-半乳糖苷酶染色结果显示,8周龄Hopx-LacZ转基因小鼠的乳腺导管内确实含有Hopx阳性细胞且位于基底上皮,数量较少。②乳腺全组织染色及免疫荧光染色结果显示,野生型小鼠的乳腺在青春期、成熟期及妊娠期等不同发育阶段具有各自相应时期依赖性的特征,并且经历了一系列复杂的上皮重塑过程。③β-半乳糖苷酶染色结果显示,与8周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠相比,妊娠17.5 d的Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠乳腺导管内Hopx标记阳性细胞增多。④β-半乳糖苷酶染色结果显示,4,8周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠他莫昔芬注射后的乳腺Hopx标记阳性细胞位于基底上皮,数量较少。⑤β-半乳糖苷酶染色结果显示,第1次妊娠17.5 d、第3次妊娠17.5 d的小鼠乳腺内的Hopx标记阳性细胞位于腺泡周围的基底上皮,数量较多,并且第3次妊娠17.5 d的Hopx标记阳性细胞数量更多。⑥结果表明,Hopx报告基因标记的细胞为休眠乳腺干细胞,负责妊娠期间乳腺的生长,对腺泡形成有贡献。

成人乳腺干细胞中乳腺癌相关基因表达的研究

目的探讨成人乳腺干细胞的分子特点。方法应用RT-PCR和免疫印记杂交方法,检测从乳腺癌旁正常组织中分离培养的具有乳腺干细胞特点的乳腺上皮细胞(SHMEC)及同源癌组织中乳腺癌相关基因C-myc,C-jun、Ras,C-erbB2的转录和表达。结果SHMEC不转录癌基因C-myc和C-jun,不表达C-erbB2及Ras癌基因蛋白,而其同源癌组织中可检测出癌基因的转录或表达。结论成人乳腺干细胞SHMEC,不具有恶性转变的分子基础,有重要的研究价值及临床意义。

牛乳腺干细胞的分离和生物学特征

为获得牛乳腺干细胞并对其生物学特征进行研究,通过悬浮培养,从体外培养的乳腺上皮细胞分离得到乳腺干细胞球,并通过RT-PCR、Western-blot、免疫组化染色和流式细胞分析对其表面抗原标记特征和分化特征进行研究。结果表明,牛乳腺干细胞表达CD29和CD49f,可以分化为腺上皮细胞和肌上皮细胞。该分离方法增加了获得牛乳腺干细胞的途径,特异性标记物CD29和CD49f可用于其生物学特征研究。

乳腺干细胞的体外培养及免疫磁珠法分离

目的:乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得。实验选取乳腺癌旁正常组织,体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的乳腺细胞,拟进一步验证在成人乳腺组织中含有可为组织工程所用的种子细胞。方法:实验于2007-03/10在吉林大学公共卫生学院放射生物学教研室完成。①细胞来源:标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科同期收治的20例女性乳腺癌患者手术切除的癌旁组织(>3cm),经病理证实为正常乳腺腺体,患者对治疗及实验均知情同意。②实验方法:去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管,剪碎成约为0.3cm3的组织块,离心,去上清,I型胶原酶消化,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行原代培养。2周后待细胞接近铺满整个培养瓶底部时,用胰蛋白酶+D-HANKS液将贴壁细胞消化分离,按1∶2或1∶3传代。利用免疫磁珠系统分离筛选乳腺成体干细胞。③实验评估:观察原代与传代培养的乳腺细胞生长特点,以及免疫磁珠分选后的乳腺干细胞形态、生长特性。采用免疫组化法对分选结果进行鉴定。结果:①体外培养的乳腺细胞生长特点:原代培养72h后可见乳腺细胞贴壁,5d后细胞呈纺锤形、多角形生长,10d后细胞生长旺盛且排列紧密,随着培养时间的延长梭形细胞逐渐占据优势。传代后细胞增殖速度加快,细胞更加均匀有序的生长。②乳腺干细胞的形态特点及生长特性:分离出的人乳腺成体干细胞生长状态良好,呈类圆形,培养3d后呈多角形分化生长。③分选结果免疫组化鉴定:免疫磁珠分选出的乳腺干细胞均表达上皮特异性抗原,而不表达唾液黏蛋白1。结论:成人乳腺组织中存在唾液黏蛋白1-上皮特异性抗原+且具有干细胞特性的乳腺细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从人乳腺癌旁正常组织中分离出来。

乳腺干细胞研究及其再生医学

关于乳腺干细胞及乳腺癌干细胞的研究，本实验室前期做了较多探索性工作，包括乳腺癌干细胞的分选、特异性乳腺癌干细胞标志物的筛选、癌基因和肿瘤抑制基因、生长因子、细胞周期、增殖和凋亡、信号转导通路、

动物乳腺干细胞的研究进展

乳腺干细胞具有产生所有类型乳腺细胞的能力。在乳腺组织生长发育过程中,乳腺干细胞对于动物青春期、妊娠期、泌乳期和泌乳衰退期的乳腺生长与重建等具有重要意义。体外培养的乳腺干细胞是研究乳腺细胞增殖、分化、生存和凋亡等信号通路的理想模型,同时在转基因乳腺生物反应器方面也具有重要的应用前景。因此,乳腺干细胞的研究对于乳腺发育的认知,乳腺癌的治疗及农业生产具有重要意义。作者针对乳腺干细胞的筛选、定位和体外培养方法的研究现状进行了系统的综述,并对未来的研究方向与应用前景加以展望。

来源于乳腺癌正常组织乳腺干细胞的安全性

背景:乳腺干细胞的培养对研究乳腺的发育及乳腺癌具有重要的意义。目的:找到一种易操作的体外分离培养乳腺干细胞的方法,并验证其安全性。方法:分离培养乳腺癌旁正常组织中乳腺上皮细胞,流式细胞仪分选CD49f和EPCAM阳性细胞进行干细胞表面标记分析及细胞集落形成能力分析,然后在乳腺干细胞、乳腺癌组织和乳腺癌旁正常组织中提取mR NA,实时荧光定量PCR检测C-erbB-2和Maspin基因的表达。结果与结论:(1)成功培养出人乳腺干细胞,并且细胞表面特异性标志物CD49f,EPCAM高表达;(2)集落形成能力分析可见混合集落、腔上皮细胞集落、肌上皮细胞集落;(3)乳腺干细胞C-erbB-2低表达,而Maspin高表达,证明来源于乳腺癌正常组织的乳腺干细胞具有生物安全性。

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成神经诱导鉴定及催乳素对其增殖活性的影响

本研究旨在探究荷斯坦奶牛乳腺干细胞的多向分化潜能及催乳素对其增殖活性的影响。采用尼氏染色法对乳腺干细胞向神经细胞分化的情况进行鉴定,利用RT-PCR技术对诱导后的乳腺干细胞进行基因水平检测;MTT法检测催乳素对乳腺干细胞增殖活性的影响。结果表明:荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成神经诱导后,细胞中有类似神经元的细胞出现,并且细胞周围出现许多微管样的结构,经尼氏染色呈阳性。诱导后神经细胞标记基因NSE和β-Tubulin Ⅲ呈阳性表达。催乳素刺激可促进乳腺干细胞的增殖,低浓度时乳腺干细胞的活力较好,且100ng·mL^(-1)为增殖最适浓度。

乳腺干细胞和乳腺癌

乳腺干细胞是一种未分化的细胞,具有永远增殖和自我更新能力。乳腺癌中的癌症干细胞可能起源于正常干细胞,以细胞表面标志CD44+/CD24-/low识别。癌症干细胞可能为肿瘤转移和复发的原因。识别乳腺癌干细胞和普通癌症细胞之间的差异,可以发展更有效的诊断和治疗方法。

乳腺干细胞自我更新相关信号通路研究进展

乳腺干细胞是来源于乳腺组织的一种成体干细胞,具有自我更新和定向分化潜能。乳腺干细胞对乳腺的发育和功能维持具有重要作用。近年来发现,乳腺干细胞与乳腺癌的发生也有密切联系。多条信号通路对乳腺干细胞的自我更新与分化起着重要作用,这些通路包括Wnt、Notch和Hedgehog通路等。了解这些信号通路的调控机制对乳腺干细胞、乳腺发育以及乳腺癌的研究均有重要意义。本文就近年来该方面的进展做一综述,以期为本领域相关研究提供参考。

乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证

背景:干细胞培养基,尤其是乳腺干细胞培养基现阶段尚无有效的制备方法。目的:利用Sca-1+乳腺细胞验证自制乳腺干细胞培养基的有效性。方法:用BM培养基培养乳腺器官样小体,6 d后以免疫荧光方法监测成纤维细胞Sca-1和vimentin的表达。筛选出MaECM培养基,培养乳腺细胞6 d后,免疫磁珠筛选Sca-1+和Sca-1-细胞群,流式细胞术分析Sca-1阳性细胞的纯度,1×104 Sca-1+或Sca-1-细胞种植在4只鼠双侧乳腺脂肪垫上,6-8周后取出乳腺脂肪垫,以卡红整体染色和苏木精-伊红染色分析长出乳腺的结构数量。结果与结论:乳腺器官样小体用BM培养基培养6 d后,检测到大量Sca-1和vimentin阳性的成纤维细胞,说明BM培养基不适合分离Sca-1+乳腺干细胞。筛选出的MaECM培养基能够抑制成纤维的生长。磁珠筛选后,流式细胞术检测Sca-1+细胞在Sca-1+和Sca-1-细胞群的纯度分别是92%和5%。移植实验显示在8个种植Sca-1+细胞的脂肪垫生长出6个乳腺结构;而在8个种植Sca-1-细胞的脂肪垫中除1只鼠死亡,其余脂肪垫中均未长出乳腺结构。提示MaECM培养基适用于培养鼠乳腺干细胞。

乳腺干细胞的识别、再生、分化及其调控

乳腺发育与再生取决于乳腺干细胞的再生。乳腺干细胞及其龛于乳腺导管发育时期分布在乳腺原基导管终端芽(TEB)帽区,在成体乳腺,以规则性的间距分布在整个乳腺导管系统,而主要位于终末导管(TD)。可利用表型标记、Sp分析及体外培养乳腺球形成以识别乳腺干细胞。乳腺干细胞后代的级别分化首先是双能祖细胞,而后,腔限制性与肌限制性细胞。妊娠可诱发具自我更新性与多能性的上皮细胞亚型PI-MEC。小鼠乳腺干细胞在青春期与妊娠期分别由雌激素与孕激素调控。乳腺干/祖细胞的自我更新与分化受Wnt、Hedgehog、Notch与TGF-beta等信号转导系统相关的诸多因素调控。

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的分离纯化与初步鉴定

本研究以荷斯坦奶牛乳腺为研究对象,旨在建立奶牛乳腺干细胞体外分离培养方法及纯化体系并对其进行初步鉴定。消毒清洗后的组织小块400 IU/m L胶原酶、37℃环境下消化20 h,初步分离得到乳腺干细胞,悬滴培养法对其进行筛选纯化,再对纯化乳腺干细胞的候选表面标记进行检测。结果表明:获得的干细胞具有自我增殖能力,并在悬滴培养条件下能够形成类似乳腺球结构细胞团,而且,不仅表达干细胞标记基因Sox2、Nanog,还表达乳腺干细胞参考标记基因CD24、CD29、CD49f,初步认定分离纯化的细胞为乳腺干细胞。

增殖乳腺干细胞——提高奶牛产奶量的新策略

选育高产品种、提供优质日粮和注射催乳激素等是目前提高奶牛泌乳量的常用方法。增殖乳腺干细胞是一种增加奶牛产奶量的新思路,目前应用报道很少。增殖乳腺干细胞可以减少和挽回因较长的干奶期和乳腺炎等因素造成的产奶量降低所引发的经济损失,具有良好的应用前景。本文综述了奶牛乳腺干细胞的生物学特征、在乳腺发育中的作用以及增殖方法等,旨在为提高奶牛泌乳量提供一种新思路。

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用。本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495)。囊胚发育率差异显著(P<0.05)。试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTES的贴壁率差异显著(P<0.05)。以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能。

成人乳腺干细胞的培养筛选及生物学特点鉴定

目的用不同的鉴定方法对应用免疫磁珠技术分离的乳腺干细胞(separated human mammary stem cell,SHMEC)进行生物学特点的鉴定。方法对原代培养的乳腺细胞用免疫磁珠方法(Magnetic Cell Sorting,MACS)进行分离。对分离后的乳腺干细胞(SHMEC)进行免疫组化,光镜,GIEMSA染色,染色体染色,电镜超微结构扫描等方法进行生物学特点的鉴定,并观察其转化为其他乳腺细胞的能力。结果光镜下可见对正常的静止期的乳腺细胞经免疫磁株分离后得到的乳腺导管上皮细胞呈椭圆型,聚集成团。GIEMSA染色可见红色椭圆型细胞及细胞核。扫描电镜下可见细胞的超微结构特点。染色体核型分析染色显示SHMEC细胞为二倍体细胞,染色体数目与正常外周血淋巴细胞相同。染色体恒定,无缺失及短臂丢失。结论从正常组织中经原代培养后分离出的乳腺上皮细胞具有乳腺干细胞的特性并不具有恶性转变的生物学特点。

动物乳腺干细胞研究进展

乳腺是一个高度活跃的器官,在青春期和生殖周期中,其上皮细胞发生了极大的变化。这些变化是由专门的干细胞和祖细胞推动的。研究乳腺干细胞对动物乳腺发育、哺乳和乳腺癌等方面都有着重大意义。如今,在乳腺干细胞生物学研究方面已经取得了显著进步。乳腺干细胞是组织学上未分化的上皮细胞,可以对称分裂产生两个相同的干细胞,或不对称地产生一个干细胞和一个腔上皮祖细胞或基底/肌上皮祖细胞。通过标记滞留细胞、染料排斥法、干细胞抗原-1标记、细胞表面标记物标记以及谱系示踪等方法可以鉴定出多种不同类型的乳腺干/祖细胞,应用多种不同方法分离鉴定乳腺干细胞有助于深入了解其异质性。乳腺的研究主要分为6个阶段:胚胎期、青春期、性成熟期、妊娠期、泌乳期和退化期。在乳腺不同发育阶段,乳腺干/祖细胞的类型及特性不同。有研究表明,在胚胎期就有基底和管腔谱系的祖细胞产生,静止的乳腺干细胞也可能来自于胚胎期,出生后,静止干细胞可以在卵巢激素的刺激作用下重新进入细胞周期,产生乳腺细胞谱系和自我更新。作者介绍了乳腺干细胞和祖细胞的存在、形态特征、鉴定方法,简述了乳腺干细胞在胚胎期、青春期和妊娠期的特征,分析了目前该领域研究的不足之处以及对未来应用的展望。

荷斯坦奶牛乳腺干细胞的成脂诱导及鉴定

为了探究荷斯坦奶牛乳腺干细胞的多向分化潜能,试验采用油红O染色法对第5代乳腺干细胞向脂肪细胞分化的情况进行鉴定,采用RT-PCR技术对诱导后的乳腺干细胞进行基因水平检测。结果表明：荷斯坦奶牛乳腺干细胞经成脂诱导后,细胞中出现油滴,经油红O染色呈阳性;诱导后脂肪细胞标记性基因LPL和PPARG呈阳性表达。说明荷斯坦奶牛乳腺干细胞具有分化为成脂肪细胞的潜能。