乳腺癌细胞条件培养基对成骨细胞增殖抑制作用的机制探讨

目的:探讨MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对hFOB1.19成骨细胞的增殖抑制作用与Notch信号通路的相关性。方法:MTT法检测MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对hFOB1.19细胞的增殖抑制效果;Western Blot与qRT-PCR分别检测hFOB1.19细胞的Notch1、Jagged1、Hes1蛋白与mRNA的表达。结果:MDA-MB-231、MCF-7条件培养基抑制hFOB1.19细胞增殖,DAPT(Notch阻断剂)可明显降低MDA-MB-231、MCF-7条件培养基对hFOB1.19细胞增殖的抑制作用。MDA-MB-231、MCF-7条件培养基上调hFOB1.19细胞Notch1、Jagged1、Hes1的mRNA和蛋白的表达,并随着条件培养基浓度的增加,以上指标的表达呈先上升而后下降的趋势。Notch阻断剂DAPT明显抑制两细胞条件培养基对hFOB1.19细胞的Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA和蛋白表达的上调作用。结论:MDA-MB-231、MCF-7条件培养基对hFOB1.19细胞增殖抑制作用的机制与Notch信号通路相关。

乳腺癌细胞条件培养基抑制成骨细胞增殖的作用研究

目的以高转移恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231和恶性程度较低的MCF-7乳腺癌细胞为研究对象,探讨两种乳腺癌细胞条件培养基对hFOB1.19细胞增殖作用的影响。方法收集MDA-MB-231、MCF-7和正常对照MCF-10的条件培养基用于hFOB1.19细胞的培养,并采用MTT法检测细胞的增殖效果,流式细胞术检测细胞的生长周期,Western blot检测其周期蛋白CyclinA2的表达。结果以加入不同用量的MDA-MB-231、MCF-7条件培养基培养hFOB1.19细胞和以60%各细胞条件培养基培养hFOB1.19细胞不同时间后,hFOB1.19细胞的增殖均受到抑制,且呈剂量和作用时间依赖性;两者明显影响hFOB1.19细胞的S期,其周期蛋白Cyclin A2的表达在低浓度出现上调,但随浓度的增加而表达下降,而正常对照MCF-10条件培养基对hFOB1.19细胞的增殖影响无显著差异。结论 MDA-MB-231、MCF-7条件培养基对hFOB1.19细胞的增殖具有抑制作用,可能与其影响hFOB1.19细胞周期的S期和Cyclin A2的表达有关。

乳酸干预破骨细胞条件培养基促进内皮细胞血管的生成

背景:聚乳酸作为可降解的骨组织工程支架材料被广泛用于组织再生与修复研究,在促进组织愈合与新骨形成、血管生成中具有重要作用。目的:观察聚乳酸降解终产物乳酸对破骨细胞的作用,以及乳酸干预后破骨细胞条件培养基对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能的影响。方法:(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,贴壁后分别加入含0,5,10,20 mmol/L乳酸的破骨诱导培养基(含核因子κB受体活化因子配体、体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基),培养5 d后分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶与细胞骨架纤维状肌动蛋白染色,培养24h后采用RT-PCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶5 m RNA表达。(2)取对数生长期的RAW264.7细胞,贴壁后分2组培养:对照组加入破骨诱导培养基,实验组加入含10 mmol/L乳酸的破骨诱导培养基,培养5 d后更换为无血清DMEM培养基继续培养24 h,离心取上清液,分别与等体积含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基混合后作用条件培养基备用。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞,分别与对照组、实验组条件培养基共培养,通过CCK-8、Transwell、划痕、成管实验观察细胞的增殖、迁移和成管能力,通过RT-PCR和Western Blot检测血管生成相关基因和蛋白的表达。结果与结论:(1)抗酒石酸酸性磷酸酶与肌动蛋白染色结果显示,5,10 mmol/L乳酸可促进RAW264.7细胞破骨向分化,其中以10 mmol/L乳酸的促进作用更显著;RT-PCR检测结果显示,5,10,20 mmol/L乳酸均可提高酒石酸酸性磷酸酶5 m RNA的表达,其中以10 mmol/L乳酸的提高作用最显著;(2)与对照组条件培养基相比,实验组条件培养基可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移与成管能力(P<0.05),提高血管内皮生长因子、血管生成素1的m RNA和蛋白表达(P<0.05);(3)结果表明,乳酸诱导分化的破骨细胞条件培养基可促进内皮细胞的血管生成,机制可能与提高血管内皮生长因子、血管生成素1表达相关。

年轻化间充质干细胞条件培养基促进小鼠创面愈合的研究

背景间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)条件培养基无细胞疗法是创伤修复领域的一种新型治疗方案,但其治疗效果受间充质干细胞状态的影响。目的探究年轻化MSC培养基对小鼠创面愈合的作用。方法建立间充质干细胞复制性衰老(传代至15~20代)模型,检测其衰老指征;使用小分子化合物[丙戊酸(valproic acid,VPA)和RepSox]逆转衰老间充质干细胞并验证逆衰老效果。分别收集衰老MSC培养基与年轻化MSC培养基。用收集到的两种条件培养基培养人成纤维细胞,使用CCK-8实验、Ki-67免疫荧光、划痕实验和Transwell实验检测这两种条件培养基对成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。分别用衰老MSC培养基、年轻化MSC培养基和0.9%氯化钠注射液治疗C57BL/6小鼠背部皮肤全层缺损模型,评估3种治疗方法对创面愈合的影响。结果与衰老的间充质干细胞相比,经小分子处理后衰老间充质干细胞SA-β-gal阳性率降低(P<0.01),且免疫荧光检测显示其衰老基因P21、P16表达降低(P<0.01)。经年轻化MSC培养基处理的成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力增强(P<0.01)。创伤模型显示,与对照组相比,年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面愈合速度加快(P<0.01);年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面HE染色显示表皮细胞再上皮化加快(P<0.01)、Masson染色显示创面胶原沉积量增加(P<0.01)、CD31免疫荧光染色显示创面血管量增加(P<0.01)。结论年轻化MSC培养基对小鼠创面修复或有促进作用。

骨髓间充质干细胞条件培养基治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效及机制

目的探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell-conditioned medium,MSC-CM)治疗大鼠糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer,DFU)的疗效与机制。方法通过高脂饮食和腹腔注射STZ建立2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)SD大鼠模型,对大鼠后肢进行手术,制作DFU模型,大鼠分为正常对照(normal control,NC)组、糖尿病对照(diabetes mellitus control,DM-C)组、MSC-CM组和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)组共4组,每组各6只。MSC-CM组在溃疡周围注射大鼠骨髓MSC-CM,MSC组给予大鼠骨髓MSC注射治疗,其他两组给予PBS注射治疗。治疗后,对创面部位皮肤愈合、再上皮化(通过HE染色检测皮肤颗粒层的厚度)、细胞增殖(通过免疫组化法检测ki-67)、血管生成(通过免疫荧光法检测CD31)、自噬(通过免疫荧光法和Western blot法检测LC3B,电镜观察自嗜溶酶体)和细胞焦亡(通过Western blot法检测IL-1β、NLRP3、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N)进行评估。结果治疗后,MSC-CM组创面面积与IL-1β、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N均低于DM-C组;MSC-CM组皮肤颗粒层厚度、ki-67、CD31和LC3B均高于DM-C组。对DFUs大鼠注射MSC-CM能够加速创面愈合、促进细胞增殖和血管生成、增强细胞自噬和减少创面中的细胞焦亡。结论MSC-CM可用于治疗大鼠DFU,加速伤口愈合过程,有望成为一种新的无细胞治疗方法。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

牙髓干细胞条件培养基联合LDH纳米材料抗HaCaT细胞光老化的作用研究

目的 探究牙髓干细胞条件培养基(DPSCs-CM)联合层状双金属氢氧化物(LDH)纳米材料对光老化HaCaT细胞的作用。方法 制备DPSCs-CM并合成LDH纳米材料。设置对照组[无预处理,无中波紫外线(UVB)照射]、模型组(无预处理,予UVB照射)、DPSCs-CM组(用含DPSCs-CM的DMEM完全培养基预处理24 h后进行UVB照射)、LDH组(用含LDH的DMEM完全培养基预处理24 h后进行UVB照射)和DPSCs-CM+LDH组(用含有等比混合的DPSCs-CM和LDH的DMEM完全培养基预处理24 h后进行UVB照射)。检测各组HaCaT细胞的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及活性氧(ROS)水平。采用细胞划痕实验检测各组HaCaT细胞的迁移能力。采用Western blot法检测各组HaCaT细胞中p53蛋白和p16蛋白的表达水平。结果 LDH纳米材料的平均粒径为65.52 nm,分散度系数(PDI)为0.109,Zeta电位为38.1 mV,表明LDH纳米材料的细胞毒性较低,纳米粒子粒径分布均一,分散性和稳定性良好。与模型组相比,DPSCs-CM组、LDH组和DPSCs-CM+LDH组HaCaT细胞的ROS水平和MDA含量降低,SOD活力升高,细胞迁移能力提高,细胞内p53蛋白和p16蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),且以DPSCs-CM+LDH组的干预效果最佳。结论 DPSCs-CM联合LDH纳米材料预处理可有效抗HaCaT细胞光老化,其效果优于单一DPSCs-CM和LDH纳米材料干预,为皮肤光老化治疗方法的研发提供了参考。

不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响

背景:利用条件培养基与人牙髓干细胞共培养,初步探索可以快速促进人牙髓干细胞增殖的方法,为今后细胞治疗、扩增高质量种子细胞提供研究基础。目的:初步探究不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响。方法:体外分离培养人牙髓干细胞,并用流式细胞术鉴定。然后将胎牛血清超高速低温离心产物、骨折患者尿液超高速低温离心产物、骨髓来源树突状细胞体外培养上清液、人皮肤成纤维细胞培养上清液与低糖DMEM培养液配置成条件培养基后,再分别与人牙髓干细胞共培养,使用细胞无标记培养观察装置(BioStation-T)连续拍摄各组细胞生长72 h的照片、使用实时无标记细胞分析仪(RTCA)动态监测150 h,比较各组细胞的标准化细胞指数值的差异。结果与结论:①人牙髓干细胞为典型的间充质干细胞形态,表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,不表达CD34和CD45;②细胞无标记培养观察装置动态监测时,发现胎牛血清超高速低温离心组的颗粒物质被吸收时间要显著早于其他实验组和空白对照组;③在实时无标记细胞分析仪检测时,与空白对照组相比,胎牛血清超高速低温离心组、骨髓来源树突状细胞体外培养上清液组、人皮肤成纤维细胞培养上清液组的标准化细胞指数值均显著升高(P<0.001),骨折患者尿液超高速低温离心组的标准化细胞指数值显著降低(P<0.001);④结果表明,胎牛血清超高速低温离心产物、骨髓来源树突状细胞体外培养上清液、人皮肤成纤维细胞培养上清液所配置的条件培养基能促进人牙髓干细胞增殖,其中胎牛血清超高速低温离心产物所配置的条件培养基对细胞还有一定保护作用。

六君子汤乙酸乙酯提取物干预CAFs条件培养基下EC9706细胞能量代谢的机制研究

目的探索六君子汤乙酸乙酯提取物(EAELD)对癌相关成纤维细胞(CAFs)条件培养基下食管癌EC9706细胞能量代谢影响的分子机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测EAELD对EC9706增殖活性的影响;比色法检测EAELD对CAFs条件培养基(CAFM)下EC9706细胞上清中乳酸及葡萄糖含量的影响;Seahorse能量代谢分析系统检测EAELD对CAFM下EC9706细胞能量代谢的影响;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测EAELD对能量代谢相关分子mRNA及蛋白表达的影响。结果与DMEM相比,除10μg/mL组外,EAELD对EC9706细胞增殖活性均有明显抑制作用(P<0.05),选取抑制浓度(IC30)25μg/mL,半抑制浓度(IC50)40μg/mL,作为低、高剂量组进行后续实验。在CAFM培养的EC9706细胞各组中,EAELD低、高剂量组都能显著降低非线粒体耗氧、基础呼吸值、最大呼吸值、合成ATP耗氧量、备用呼吸能力、基础糖酵解、补偿糖酵解、糖酵解潜能(P<0.01),减少EC9706细胞上清乳酸含量(P<0.01),下调GLUT1的mRNA表达(P<0.05,P<0.01),下调p-PKM2、HK2、PKM2、MCT1蛋白表达(P<0.01);EAELD高剂量组能够下调EC9706细胞的线粒体耗氧与基础糖酵解比值(P<0.05),减少EC9706细胞葡萄糖摄取(P<0.05),下调p-PKM2、GLUT1的蛋白表达(P<0.01,P<0.05);EAELD低剂量组能够下调MCT1的mRNA表达(P<0.05)。结论六君子汤乙酸乙酯提取物能够干预CAFs条件培养基下EC9706细胞的能量代谢,其机制可能与EAELD调控HK2、PKM2、GLUT1、MCT1、MCT4的mRNA和蛋白表达相关。

鹿茸间充质干细胞条件培养基对乳腺癌细胞系4T1的作用

本试验主要探讨了鹿茸间充质干细胞条件培养基对乳腺癌细胞4T1的作用。分离、培养、鉴定了鹿茸间充质干细胞,采用MTT法检测了鹿茸间充质干细胞条件培养基对4T1细胞的增殖活性的影响,并通过Western blot检测了对4T1细胞凋亡的影响。结果显示,鹿茸间充质干细胞条件培养基可抑制4T1细胞的增殖,并呈浓度依赖性,并伴有4T1细胞内Cleaved-caspase 3蛋白表达上调以及Bcl-xl蛋白表达的下调。这一结果表明,鹿茸间充质干细胞条件培养基可抑制4T1细胞增殖,其机制与细胞内凋亡信号通路有关。

外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

背景:近来多数研究将组织工程材料与干细胞或细胞因子复合来改善动物模型皮肤损伤。鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉可以长期保存,用于修复皮肤损伤具有独特的优势。目的:观察外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤缺损的效果。方法:体外培养SD大鼠鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞,第3代细胞的培养基透析后冷冻干燥制成冻干粉。将30只皮肤缺损SD大鼠按治疗方法分为3组(n=10):损伤对照组,不接受特殊治疗作为对照;纤维蛋白胶组,局部应用纤维蛋白胶;条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组,局部应用含有外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉的纤维蛋白胶。治疗后动态观察创面愈合情况,测量创面面积,对皮肤组织切片进行苏木精-伊红染色和CK8、P63免疫组化染色。结果与结论:条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面愈合速度高于纤维蛋白胶组和损伤对照组(P<0.001)。条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面表皮和真皮在21 d全部再生修复;纤维蛋白胶组再生皮肤较薄;单纯创伤组皮肤再生不完全。在大鼠模型中,外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶联合使用可以促进损伤皮肤的伤口愈合。

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤

背景:间充质干细胞条件培养基被认为是干细胞移植的良好替代方案。既往研究表明,炎症因子的诱导激活能增强间充质干细胞多种生物学潜能,而正常状态的间充质干细胞可能由于免疫活性和迁徙能力不足,无法有效修复损伤组织。目的:探讨炎症预激活前后骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射损伤小肠上皮治疗作用的差异。方法:分离、培养、鉴定SD幼鼠骨髓间充质干细胞,分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24 h,预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h,收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM NOR)和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM IR)。将成年SD大鼠随机分为4组,正常对照组、辐射损伤组、MSC-CM NOR治疗组和MSC-CM IR治疗组,以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型,模型制备后尾静脉注射和植入式胶囊渗透压泵腹腔植入联合给药。于治疗后第1,3,7天取小肠组织检测短回路电流和血清木糖水平观察小肠分泌、吸收功能变化。治疗后第3天取小肠组织行电镜观察超微结构改变,治疗后第1,3,5,7,14天取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠黏膜组织学改变。记录各组大鼠生存状态及生存时间。结果与结论:输注MSC-CM IR后,大鼠小肠短回路电流差值、血清木糖水平较辐射损伤组升高,差异有显著性意义(P<0.05)。苏木精-伊红染色和电镜观察显示从治疗后第3天起MSC-CM IR组小肠黏膜病理改变明显减轻,上皮厚度、紧密连接间隙明显优于辐射损伤组。生存分析显示MSC-CM IR组生存率和平均生存时间明显改善(P<0.05),而MSC-CM NOR组的各项指标与辐射损伤组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明炎症激活状态下的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进辐射损伤小肠结构和功能的修复。

模拟失重骨细胞条件培养基对成骨细胞活性的影响

目的探讨三维随机回转模拟失重培养后的骨细胞条件培养基(RCM)对成骨细胞活性的调节作用。方法采用三维随机回转模拟失重培养小鼠骨细胞系MLO-Y448h后,收集回转条件培养基(RCM)和未回转对照组的条件培养基(CCM),用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法、对硝基苯磷酸(pNPP)法和流式细胞术(FCM)检测RCM对小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1增殖、周期及细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果三维随机回转48h后的MLO-Y4RCM可促进MC3T3-E1增殖,用100%的MLO-Y4RCM和CCM培养MC3T3-E148h和72h后,RCM组比CCM组分别增加了1.21和1.27倍,差异性极显著(P<0.001);周期检测结果表明,RCM可以使MC3T3-E1越过周期阻滞点(S期);MC3T3-E1的ALP活性在RCM组和CCM组之间无差异。结论三维随机回转模拟失重培养骨细胞48h后的条件培养基促进了成骨细胞的增殖;并使成骨细胞的周期越过阻滞点,对成骨细胞的ALP活性无影响。

培养基和培养条件与红豆杉细胞培养中褐化的关系

就近几年来通过培养基和培养条件的选择来控制和防止红豆杉细胞培养中的褐化问题作了介绍。

大鼠心肌条件培养基对形成小鼠ES细胞集落的影响

报道一种新的从小鼠囊胚中培养和分离出ＥＳ细胞集落的方法。取出生２～３周龄大鼠的心肌组织制备单层培养物，收集６代以内的条件培养基（ＲＨＣＭ）。以ＲＨＣＭ培养Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的囊胚（无饲养层），对照组以小鼠胚胎原代成纤维细胞（ＭＥ）为饲养层，并补加ＬＩＦ因子。经过１９０个胚的实验证明，以ＲＨＣＭ为培养基培养小鼠囊胚时，胚胎贴壁率、ＩＣＭ增殖率和ＥＳ细胞集落的出现率与对照组没有显著性差异，分别为６７％、９３％和１３％。这种新的方法为简便而有效地建立与培养小鼠ＥＳ细胞系提供了有益的资料。

肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用

目的 :探讨肝脏细胞条件培养基诱导大鼠骨髓间质细胞分化为肝细胞的作用。方法 :从大鼠骨髓中分离纯化培养间质细胞 ,诱导前 2 4小时加 1μg/L碱性成纤维生长因子 (bFGF)入培养液中以促进细胞分裂 ,再以肝脏细胞条件培养基作诱导剂 ,分别在诱导培养 0、 7、 14、 2 1、 2 8天时 ,留取细胞 ,观察细胞形态的变化 ,并采用免疫细胞化学方法检测肝细胞功能标志物 (AFP、白蛋白、CK18)、用PAS法进行糖元染色试验 ,以验证诱导分化的结果。结果 :诱导后 3天间质细胞表现为肝细胞样 ,随着诱导时间的延长 ,肝细胞功能标志逐渐出现和成熟。AFP在 7、 14天时表达较高 ,2 1、 2 8天时表达显著减少 ;白蛋白、CK 18和糖元随着诱导时间的延长表达逐渐增多。结论 :肝脏细胞条件培养基能诱导骨髓间质细胞分化为肝细胞。

新生大鼠原代软骨细胞分离和培养方法的改进

目的:探讨新生大鼠原代软骨细胞分离和培养的改进方法,以建立高效经济的体外软骨细胞培养体系。方法:从新生大鼠关节中分离原代软骨细胞,分为过夜消化(OD)组和快速消化(RD)组进行分离,OD组软骨细胞采用Ⅱ型胶原酶过夜消化,RD组软骨细胞采用预消化的物理化学消化相结合的手段分离细胞。采用含0%(空白组1)、1%、2%、4%和10%胎牛血清(FBS),0(空白组2)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0 g·L^(-1)维生素C(VC)和0(空白组3)、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μg·L^(-1)聚乳酸-羟基乙酸共聚体(PLGA)纳米粒子的改良培养液培养软骨细胞。将杜氏改良Eagle培养基F12营养混合液(DMEM/F12)与含不同浓度FBS、VC和PLGA的培养液分别混合,并按照各成分浓度进行相应分组。采用细胞计数仪计数各组细胞并检测各组细胞存活率和直径,采用甲苯胺蓝特异性染色法检测各组细胞形态表现,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,采用细胞黏附实验检测各组细胞黏附率,采用Hoechst/碘化丙碇(PI)染色检测各组细胞凋亡情况,采用MTT法检测改良培养液培养后各组细胞增殖活性,将细胞分为DMEM/F12+10%FBS组(对照组)、DMEM/F12+1%FBS组、DMEM/F12+1%FBS+0.4 g·L^(-1)VC+1μg·L^(-1)PLGA组,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测改良培养液培养后各组细胞中性别决定区域Y框转录因子9(SOX9)、Ⅱ型胶原α1链(Col2A1)、Ⅹ型胶原α1链(Col10A1)和基质金属蛋白酶13(MMP13)mRNA表达水平,采用免疫荧光染色检测改良培养液培养后各组细胞中Ⅱ型胶原(COLⅡ)和SOX9表达情况。结果:OD组原代软骨细胞存活率小于RD组,细胞平均直径大于RD组。OD组原代软骨细胞形态较大,呈梭形,大多数细胞出现伪足;RD组原代软骨细胞形态较小,大多数细胞呈菱形,仅部分细胞出现伪足。2组原代软骨细胞经甲苯胺蓝特异性染色均显色明显,但RD组消化时间较短,软骨细胞实际培养时间较OD组缩短9~13 h,原代软骨细胞形态更为幼稚。OD组原代软骨细胞在培养24 h时增殖较为缓慢,培养48 h时增殖速度升高,较培养12 h时增殖活性明显升高(P<0.01)。RD组原代软骨细胞在培养24 h时增殖稍缓,培养48 h时增殖速度加快,较培养12 h时增殖活性明显升高(P<0.01);培养24和48 h时,与OD组比较,RD组原代细胞增殖速度升高(P<0.05)。RD组软骨凋亡细胞数少于OD组,2组均无坏死软骨细胞。大鼠软骨细胞增殖活性随着培养液中FBS浓度升高而升高,与空白组1比较,培养液中含1%、2%、4%和10%FBS时,软骨大鼠细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。与空白组2比较,培养液中含0.2~1.0 g·L^(-1)VC时大鼠软骨细胞增殖活性明显升高(P<0.05),其中含0.4 g·L^(-1)VC时大鼠软骨细胞增殖活性最高(P<0.01)。与空白组3比较,培养液中含1~4μg·L^(-1)PLGA时,大鼠软骨细胞增殖活性明显升高(P<0.05),其中含1μg·L^(-1)PLGA时大鼠软骨细胞增殖活性最高(P<0.05)。与DMEM/F12+10%FBS组比较,DMEM/F12+1%FBS组大鼠软骨细胞中SOX9 mRNA和COL2A1 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与DMEM/F12+10%FBS组比较,DMEM/F12+1%FBS+0.4 g·L^(-1)VC+1μg·L^(-1)PLGA组大鼠软骨细胞中SOX9 mRNA和COL2A1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。免疫荧光染色,荧光显微镜下DMEM/F12+10%FBS组部分软骨细胞中出现COLⅡ绿色荧光信号和SOX9红色荧光信号,荧光强度弱;DMEM/F12+1%FBS组大多数软骨细胞中出现COLⅡ绿色荧光信号和SOX9红色荧光信号,荧光强度明显强于DMEM/F12+10%FBS组;DMEM/F12+1%FBS+0.4 g·L^(-1)VC+1μg·L^(-1)PLGA组软骨细胞中均出现COLⅡ绿色荧光信号和SOX9红色荧光信号,荧光强度较DMEM/F12+10%FBS组和DMEM/F12+1%FBS组明显升高。DMEM/F12+1%FBS组软骨细胞中COLⅡ和SOX9蛋白表达量明显高于DMEM/F12+10%FBS组,DMEM/F12+1%FBS+0.4 g·L^(-1)VC+1μg·L^(-1)PLGA组软骨细胞中COLⅡ和SOX9蛋白表达量明显高于DMEM/F12+10%FBS组。结论:改良后的大鼠原代软骨细胞分离和培养方法可以弥补传统方法的缺陷,缩短原代软骨细胞的分离时间,提高原代软骨细胞的体外培养质量。

间充质干细胞条件培养基激活Nrf2/ARE通路对抗H_2O_2致H9c2细胞的氧化应激损伤

目的:探讨间充质干细胞(MSC)条件培养基(MSCCM)对氧化应激损伤的心肌细胞的保护作用及机制。方法:用流式细胞术对MSC进行鉴定,再用MTT实验确定MSCCM对抗H2O2氧化应激损伤的最佳孵育时间。将H9c2细胞分为正常组、模型组、模型+MSCCM组和MSCCM组。模型+MSCCM组和MSCCM组均用MSCCM进行预孵育24 h,模型组和模型+MSCCM组用浓度为300μmol/L的H2O2作用4 h模拟心肌细胞的氧化应激损伤。利用流式细胞术检测损伤后心肌细胞的线粒体膜电位变化、凋亡比率等指标,通过荧光显微镜检测细胞ROS产生的变化,Western blot检测Nrf2/ARE通路的相关蛋白表达。结果:MSCCM组心肌细胞的线粒体膜电位、凋亡比率和ROS产生与正常组相比均无显著差异(P>0.05);模型+MSCCM组的线粒体膜电位、凋亡比例和ROS产生与模型组相比差异显著(P<0.01);在0 h到24 h这段时间内,心肌细胞Nrf2/ARE通路中的Nrf2核转位与HO-1表达均随着MSCCM孵育时间延长而增加。结论:MSCCM可以保护心肌细胞,对抗H2O2诱导的氧化应激损伤,其机制可能与激活Nrf2/ARE通路有关。

条件培养基培养神经干细胞的体外实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)条件培养基对神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法提取第3代大鼠BMSCs条件培养基,浓缩后加到NSCs培养基中,对所培养的NSCs进行形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果在加入大鼠BMSCs条件培养基的实验组,24 h内见悬浮生长的NSCs球开始贴壁生长。至第3天,所有悬浮细胞球基本贴壁生长,大量细胞从中爬出,伸出突起。第7天时,伸出细胞交织成网。对贴壁分化后的NSCs进行免疫化学染色,其表达神经元和胶质细胞的特异性蛋白。而未加入条件培养基的对照组,NSCs仍呈悬浮生长,未见大量细胞贴壁生长及分化。结论在完全去除BMSCs细胞的情况下,含有大鼠BMSCs分泌的细胞因子的条件培养基对NSCs的贴壁分化有显著的促进作用。

人毛乳头细胞条件培养基对毛乳头细胞的作用

目的:研究人毛乳头细胞条件培养基对高传代人毛乳头细胞的生物作用。方法:通过体外培养低传代的人毛乳头细胞,收集其上清配制成条件培养基,用此条件培养基培养高传代人毛乳头细胞,观察其细胞的3H-TdR计数值及细胞超微结构的变化。结果:用低传代人毛乳头细胞上清液培养过的高传代人毛乳头细胞3H-TdR计数值明显高于对照组(P<0.01)。在电镜下可见高传代人毛乳头细胞核糖体丰富、内质网分泌成池。结论:低传代人毛乳头细胞条件培养基有明显促进高传代人毛乳头细胞活性的作用。