白藜芦醇对乳腺癌BT474细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的探讨白藜芦醇对乳腺癌BT474细胞增殖、凋亡的影响及相关作用机制。方法将不同浓度白藜芦醇作用于BT474细胞,CCK-8法观察白藜芦醇对BT474细胞生长增殖的影响,Annexin V-FITC/PI双染法观察白藜芦醇对BT474细胞凋亡的影响,qRT-PCR检测BT474细胞中GABARAPL1表达改变。结果以白藜芦醇处理后的BT474细胞增殖被抑制并且凋亡增加,呈时间—剂量依赖性,且可抑制GABARAPL1的表达。结论白藜芦醇可通过下调GABARAPL1抑制BT474细胞增殖并诱导其凋亡。

Prefoldin 1对乳腺癌BT474细胞上皮-间充质转化的影响

目的探讨Prefoldin 1(PFDN1)对乳腺癌BT474细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法将PFND1基因RNA干扰真核表达载体和空白对照基因表达载体导入BT474细胞,构建转染组及空白转染组,另设未转染组。通过Transwell侵袭实验和迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力,采用real-timePCR和western blot检测EMT标志分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达水平。结果转染组PFND1mRNA和蛋白表达显著低于其他两组(P <0.05)。转染组细胞侵袭和迁移能力低于其他两组(P <0.05)。转染组E-cadherin表达明显强于其他两组(P <0.05),N-cadherin、Vimentin表达明显低于其他两组(P <0.05)。结论 PFDN1能够促进乳腺癌BT474细胞EMT转化。

调控FOXM1基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响

目的探究调控叉头框转录因子M1(FOXM1)基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响。方法将FOXM1过表达及特异性靶向FOXM1基因的小干扰RNA(FOXM1-siRNA)转染至乳腺癌BT474细胞,将细胞分为上调FOXM1基因组、下调FOXM1基因组和对照组。Western blot检测FOXM1蛋白以及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。MTT法检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞增殖能力的影响。Transwell实验检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞迁移、侵袭能力的影响。结果下调FOXM1基因后,FOXM1蛋白的相对表达量明显减少(P<0.05)。上调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著高于对照组,且随着赫赛汀浓度的增加其增殖率、迁移数量、侵袭数量逐渐增加,上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性,促进增殖、迁移及侵袭。下调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于对照组,低浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制程度较弱,高浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制过度,而中浓度的赫赛汀抑制能力介于低、高浓度之间,能够有效抑制BT474细胞增殖、迁移及侵袭,但无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下下调FOXM1基因组细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于上调FOXM1基因组。下调FOXM1基因组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均低于对照组和上调FOXM1基因组(P<0.05)。结论上调FOXM1基因可增强乳腺癌BT474细胞对赫赛汀的耐药性,下调FOXM1基因在中浓度赫赛汀的干预下,可通过作用于PI3K/AKT信号通路,抑制乳腺癌BT474细胞的增殖、迁移及侵袭,从而抑制乳腺癌的发展。

过表达Bmi-1基因对乳腺癌细胞株BT474侵袭转移能力的影响

目的建立过表达Bmi-1的乳腺癌稳定细胞株,检测过表达Bmi-1对该肿瘤细胞株侵袭转移能力的影响,探讨Bmi-1与乳腺癌转移的相关性。方法根据GenBank中人源Bmi-1的mRNA序列,设计引物,构建Bmi-1真核表达载体GV144-Bmi-1,将其转染乳腺癌细胞株BT474,G418筛选建立过表达Bmi-1的稳定细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测Bmi-1的mRNA和蛋白表达水平,Matrigel和Transwell侵袭小室模型检测转染和未转染BT474细胞体外侵袭和转移能力的变化,荧光定量PCR和Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的变化。结果成功构建人源Bmi-1真核表达载体GV144-Bmi-1,转染BT474细胞后,获得稳定转染细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,与空载体组相比,实验组Bmi-1的mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。Bmi-1过表达后,迁移能力明显增强、穿膜细胞数明显增多,MMP-2、MM-9 mRNA和蛋白表达水平显著增强(P<0.05)。结论过表达Bmi-1稳定细胞株构建成功,Bmi-1表达上调可显著提高乳腺癌细胞的体外侵袭转移能力。

阳和汤对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的观察阳和汤对人三阴性乳腺癌细胞BT549凋亡及STAT1/p53信号通路的影响,探讨其抑制三阴性乳腺癌发展的可能机制。方法将BT549细胞分为空白对照组、阳性药组及阳和汤低、中、高剂量组,分别用灌胃蒸馏水、5-氟尿嘧啶及阳和汤低、中、高浓度药液后的血清进行干预,DAPI染色和流式细胞术检测细胞周期及凋亡,q RT-PCR检测细胞信号传导和转录激活因子(STAT)1、p53 mRNA表达,Western blot检测STAT1/p53信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、p53及Bax蛋白表达。结果与空白对照组比较,阳和汤低、中、高剂量组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞比例增加,G2/M期细胞比例降低(P<0.05,P<0.01),阳和汤高剂量组细胞STAT1、p53 mRNA表达明显升高(P<0.01),阳和汤中、高剂量组细胞STAT1、p53、Bax蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),阳和汤低、中、高剂量组细胞STAT3蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论阳和汤能诱导BT549细胞凋亡,其机制与调控STAT1/p53信号通路相关因子STAT1、STAT3、p53和Bax表达有关。

KU004抑制人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型肿瘤生长的作用

目的探讨KU004对人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型肿瘤的抑制作用。方法对60只雌性BALB/c裸鼠接种人源乳腺癌BT474细胞,将肿瘤生长至100～160 mm^3的40只裸鼠随机分为模型组(0.5%羟丙基甲基纤维素溶液灌胃)、拉帕替尼组(80 mg/kg拉帕替尼灌胃)、KU004高剂量组(120 mg/kg KU004灌胃)、KU004中剂量组(80 mg/kg KU004灌胃)、KU004低剂量组(40 mg/kg KU004灌胃),每组8只,每天灌胃1次,连续灌胃21 d。分别于给药前以及给药后1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、17 d、21 d测量各组裸鼠体重及肿瘤体积,计算相对肿瘤增殖率(T/C)和肿瘤抑制率(inhibition rate,IR)。结果成功建立人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型。拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组、KU004低剂量组裸鼠体重随给药时间延长变化不大,与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。给药期间各给药组TV、RTV均低于与模型组(P<0.01),其中拉帕替尼组与KU004中剂量组TV、RTV比较差异无统计学意义(P>0.05)。拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组和KU004低剂量组T/C随给药时间延长逐渐降低,至给药后21 d T/C分别为15.6%、6.9%、11.4%和32.7%,IR分别为85.0%、95.0%、91.0%和67.0%。结论不同剂量KU004均可对人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型肿瘤生长产生抑制作用,且裸鼠耐受性良好。

下调晚期糖基化终末产物受体对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响

目的 :研究下调晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。方法 :培养乳腺癌BT474细胞,分为对照组(不做任何处理的乳腺癌BT474细胞)、上调组(乳腺癌BT474细胞+RAGE阴性对照)、下调组(乳腺癌BT474细胞+RAGE siRNA)。用四甲基偶氮唑盐法检测乳腺癌细胞增殖、凋亡水平;用Transwell法检测乳腺癌细胞迁移、侵袭水平;用免疫印迹法检测细胞PI3K/Akt信号通路蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、caspase3、Bcl-2、Bax表达量。结果 :下调组细胞不同时间点增殖率均显著低于上调组、对照组。下调组细胞不同时间点凋亡率均显著高于上调组、对照组。下调组细胞迁移、侵袭数均显著低于上调组、对照组。下调组p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达量低于上调组、对照组,caspase 3、Bax蛋白表达量高于上调组、对照组。结论 :经下调RAGE作用于PI3K/Akt信号通路,其可抑制p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2表达,促进caspase 3、Bax表达,致乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移。

舒芬太尼对BT474细胞恶性生物学行为影响及机制研究

目的探讨舒芬太尼对BT474人乳腺导管癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制。方法体外培养BT474人乳腺导管癌细胞,随机将细胞分为对照组(C组)和舒芬太尼组,C组仅使用1640完全型培养基培养,舒芬太尼组分别给予含不同剂量舒芬太尼[0.1 nmol·L^(-1)(L组),1 nmol·L^(-1)(M组),10 nmol·L^(-1) L(H组)]的1640完全型培养基培养;处理时间24 h。采用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,血管形成实验检测血管生成能力,Western blot实验检测细胞生长、转移和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达。结果与C组比较,舒芬太尼组细胞克隆形成能力逐渐降低、细胞迁移率和细胞侵袭数逐渐减少(P均<0.05)、血管生成能力逐渐降低且均与浓度呈剂量相关性(P均<0.05);Western blot结果显示,与C组比较,L组MMP-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05),M组和H组MMP-9、N-cadherin蛋白表达量下调,E-cadherin蛋白表达量上调(P均<0.05),VEGF与Vimentin蛋白随舒芬太尼组干预剂量浓度的增加,蛋白表达均呈下调改变(P均<0.05)。结论舒芬太尼可抑制BT474人乳腺导管癌细胞生长、转移及血管形成,这一过程可能与EMT的发生有关。

帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

目的 探讨帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响,及其作用机制。方法 体外培养BT474乳腺癌细胞,分为对照组和低、中、高剂量实验组。对照组在正常培养基中培养24 h;低、中、高剂量实验组分别置于含100,300和500μmol·L^(-1)帕瑞昔布钠的RPMI-1640培养基中培养24 h。用细胞计数法-8(CCK-8)实验检测细胞的增殖能力,用划痕实验检测BT474细胞的迁移能力,用Transwell实验检测细胞的侵袭能力,用Western blot法检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和胱天蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的表达情况。结果 处理24 h后,低、高剂量实验组和对照组的细胞增殖抑制率分别为(20.28±1.33)%,(67.91±2.35)%和(100.00±0)%,细胞迁移率分别为(20.84±2.15)%,(5.77±0.72)%和(26.03±2.09)%,细胞侵袭数分别为(1.72×10~4±397.00),(0.83×10~4±532.00)和(2.04×10~4±925.00)个,Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.92±0.04,0.17±0.04和1.79±0.11,Bax蛋白相对表达量分别为0.51±0.05,1.21±0.11和0.38±0.02,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.82±0.08,1.98±0.17和0.33±0.06;低、高剂量实验组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 帕瑞昔布钠可抑制BT474乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力,其机制可能与调控细胞凋亡信号通路有关。

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p<0.01,p<0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p<0.01),间质标志蛋白Vimentin(p<0.05)、N-cadherin(p<0.01)和Fibronectin(p<0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p<0.05,p<0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。

AKT3基因重组腺病毒表达载体的构建及其对BT474乳腺导管癌细胞增殖的影响

目的构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体，探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响。方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3eDNA，以XhoI及最g21I酶切位点克隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体，测序鉴定后与骨架载体PAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，获得重组腺病毒表达载体pAd．AKT3后，转染293A细胞，进行病毒的包装。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光，测定病毒效价，Western印迹方法分析细胞内AKT3蛋白质的表达。通过MTr实验，研究AKT3过表达前后BT474乳腺导管癌细胞增殖的变化。结果重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误。重组腺病毒效价为2．6×10^8pfu／ml，重组腺病毒转导后，BT474乳腺导管癌细胞中可检测到AKT3的过表达：Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在BT474细胞中表达良好。而转导空载体腺病毒及未转导细胞对照中未见有此融合蛋白质条带；MTr结果显示AKT3表达上调的重组腺病毒组，其增殖活性显著高于转导空载体腺病毒组及未转导细胞组，差异具有统计学意义（P〈0．01），而后两者差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功地构建了AKT3重组腺病毒表达载体，AKT3过表达可增强BT474乳腺导管癌的增殖，为进一步研究AKT3的功能奠定了基础。

猪苓酮A通过调节Bcl-2/Bax信号通路诱导雌激素受体阴性的乳腺癌细胞凋亡研究

目的研究猪苓酮A对雌激素受体(ER)阳性或阴性人乳腺癌细胞的凋亡作用及其可能的作用机制。方法选择2株ER阳性人乳腺癌细胞(MCF-7细胞、BT474细胞)和1株ER阴性人乳腺癌细胞(MDA-MB-453细胞),用不同浓度的猪苓酮A分别处理24 h,或以50μmol/L的猪苓酮A分别处理6、12、24、48 h后,分别采用噻唑蓝(MTT)法测定3株乳腺癌细胞的增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;采用Western blottig法检测与细胞凋亡密切相关的Bcl-2家族蛋白表达情况。结果猪苓酮A可以时间和剂量依赖性地抑制ER阴性MDA-MB-453细胞的增殖;而对于ER阳性MCF-7、BT474细胞增殖均无明显影响;细胞周期检测显示猪苓酮A可以使MDA-MB-453细胞的生长阻滞在G1或G2/M期;50μmol/L猪苓酮A作用于MDA-MB-453细胞24 h后,细胞出现明显凋亡,而MCF-7、BT474细胞则没有出现明显凋亡;Western blotting检测发现50μmol/L猪苓酮A处理组ER阴性MDA-MB-453细胞中促凋亡蛋白Bax、Bad表达量升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w表达量降低。结论猪苓酮A能抑制ER阴性乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制与调控Bcl-2家族蛋白的表达量有关。