马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种real-time PCR检测方法的建立与应用

本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立real-time PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性和混合体系等进行检测。结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,建立real-time PCR的标准曲线,其决定系数R2为0.965,具有良好的线性关系,且在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种及混合体系中可以特异性检出。综上,本研究建立的real-time PCR法可以快速、准确地检测马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种,为马乳酒样乳杆菌的特异性定性定量检测提供了一种新的方法。

马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的毒理学安全性评价

为评估马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3食用安全性及健康风险,对ZW3进行系统的体外和体内毒理学实验,包括SD大鼠急性经口毒性实验、细菌回复突变实验、小鼠骨髓细胞微核实验和仓鼠卵巢细胞染色体畸变实验。急性经口毒性实验表明:ZW3的LD50大于10.0 g/kg体重;细菌回复突变实验结果显示:ZW3对5株测试菌株无诱变特性,在小鼠骨髓细胞微核实验中ZW3不会导致哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加;仓鼠卵巢细胞染色体畸变实验结果表明:ZW3的不同剂量组中染色体异常细胞和染色体畸变率均与阴性对照组无明显差异。综合评价,马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3属于实际无毒级,并且不存在遗传毒性、致突变和致癌性。

1株马乳酒样乳杆菌的分离鉴定及益生特性研究

【目的】从新疆克州地区传统发酵马奶酒中分离既有抗菌活性又有抗氧化活性的乳酸菌,继而获得能用于微生态制剂开发的优良菌株。【方法】采用MRS固体培养基进行乳酸菌分离培养,筛选优势菌株,观察菌体形态学特征,并通过16S rRNA基因序列分析进行分子鉴定。研究菌株的生长曲线、产酸能力、耐酸能力、耐胆盐能力和抑菌能力,通过检测菌株耐H_(2)O_(2)能力及菌株发酵液、无细胞提取物、菌体混悬液的DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除能力、羟自由基清除能力等相关指标来评价菌株体外抗氧化功能,并通过药敏试验和小鼠饲喂试验评估菌株的安全性。【结果】试验筛选出1株菌落形态圆形、白色半透明、边缘不整齐的革兰氏阳性菌,将其命名为JK-24,经16S rRNA克隆测序鉴定该菌株为马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)。在6~18 h,D_(600 nm)值增长速度较快,进入对数生长期,JK-24发酵液pH下降明显;JK-24在pH 2.5~6.5范围内均能生长,能耐受0.3%胆盐;发酵液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为15和20 mm,具有良好抑菌活性;能耐受浓度为3.0 mmol/L的H_(2)O_(2),且在H_(2)O_(2)浓度为1.0和2.0 mmol/L时对菌株生长有促进作用;JK-24发酵液和无细胞提取物的DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除能力和羟自由基清除能力均显著高于MRS培养基(P<0.05);对青霉素等19种抗生素敏感;灌胃JK-24对小鼠生长性能和脏器系数均无显著影响(P>0.05),血液学参数均处于正常范围内,体内脏器无眼观病理变化。【结论】本试验分离到的马乳酒样乳杆菌JK-24安全、无致病性,具有良好的抑菌和抗氧化等益生特性,可作为生物饲料添加剂的菌种来源。

产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18益生基因分析

产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种(Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens)作为新食品原料具有很多益生特性,该研究利用全基因组测序对产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18基本特征和益生功能基因进行全面分析。结果表明,该菌株由一个环状染色体和两个质粒组成,全长约2.4 Mbp,有更多独特基因和特性。通过数据库注释可得菌株ZW18具有较好的生存能力与稳定性,且对碳水化合物利用能力强,保证了菌体细胞的物质基础和能量供给。该菌株基因组中含有与抵抗氧化应激、耐酸耐胆盐、黏附和聚集、免疫、细菌素等相关的基因,与硫胺素、核黄素等多种维生素及赖氨酸、蛋氨酸等人体所需氨基酸合成相关基因,表明其具有多种潜在益生特性,为进一步深入研究与应用提供基础数据。

牛乳经酵母菌和乳酸菌发酵生产低醇乳酒的研究

用鲜牛乳为主要原料,添加蔗糖和营养素等辅料,经酵母和乳酸菌混合接种发酵,生产出低醇乳酒。通过对2种菌发酵方式的选择、协同性发酵实验、乳酸菌接种量和营养素的添加、发酵条件优化及发酵过程分析和发酵终点确定的研究,结果表明,当蔗糖添加量为10%时,乳酸菌的接种量为1%;牛乳酒生产的最佳配方及工艺条件是牛乳用量30%,营养素添加量70mg/L,酵母接种量8%,温度28℃。经生产性实验,在总发酵时间28h,乳酒产品酒精含量达到2·02%,呈乳白色,状态均匀,泡沫细腻,乳香、酒香和谐一体。

酶解牛乳蛋白多肽复合果汁乳酒工艺研究

为克服传统乳酒缺陷,该文采用蛋白酶水解法及酒精酵母乳酸菌混合发酵法研究了牛乳蛋白多肽复合果汁乳酒的生产工艺。通过对比和正交试验确定了牛乳蛋白的最佳水解酶、水解条件及牛乳蛋白多肽复合果汁乳酒的发酵条件和配方。结果表明:牛乳蛋白的最佳水解酶是中性蛋白酶,最佳水解条件是:酶用量140mg/L,温度50℃,pH6.5,酶解5h,牛乳蛋白水解最彻底;牛乳蛋白多肽复合果汁乳酒的最佳发酵条件为经中性蛋白酶水解的牛乳,用蔗糖调整其糖度为15%,再配以4%的猕猴桃浓缩汁,添加0.35%kefir发酵剂在25℃发酵12h,发酵液中的酒精及总酸含量较高;牛乳蛋白多肽复合果汁乳酒的最佳配方组成是:发酵液60%、糖6%、酸0.28%、甜味剂0.1%、稳定剂0.5%、复合香精0.06%、风味增强剂8mg/L,乳酒品质最好。

乳酒隐球酵母变种CK-1产β-半乳糖苷酶发酵条件优化

β-半乳糖苷酶是一类非常重要的糖苷水解酶,已被广泛应用于食品工业降低乳制品中的乳糖含量.本文通过单因素实验和L9(34)正交实验,对乳酒隐球酵母变种CK-1产生β-半乳糖苷酶的培养基组成和发酵条件进行了优化.结果表明,在以乳糖2.0%、硫酸亚铁铵2.0%、磷酸二氢钾0.4%、起始pH6.0的培养基中,按接种量8%接种后,于30℃,120 r.min-1培养CK-1菌株2 d,β-半乳糖苷酶活力可达(17.02±0.38)U.mL-1,是优化前(基础发酵培养基酶活力(5.39±0.20)U.mL-1)的3.16倍.通过优化培养条件提高了CK-1菌株的产酶量,为商业化β-半乳糖苷酶的大量生产降低了成本.

一株马乳酒样乳杆菌胞外多糖的理化性质

ZW3胞外多糖是由分离自西藏开菲尔粒中的马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种ZW3分泌产生,文中针对此多糖进行了理化特性的分析与表征。实验中,傅立叶变换红外光谱表明此多糖存在羧基、羟基和酰胺基,与典型的异型多糖结构相一致。气相色谱分析表明此多糖仅由半乳糖和葡萄糖构成。ZW3胞外多糖絮凝能力与黄原胶相似,比瓜尔胶的絮凝能力要强。相对于商业用途亲水胶体黄原胶、瓜尔胶和刺槐胶来说,ZW3胞外多糖具有更强的乳化能力,因此它具有作为商业用乳化剂的潜力。以上特性表明ZW3胞外多糖在工业应用方面特别是食品工业上拥有广阔的前景。

胡萝卜嗜酸乳杆菌乳酒的研制

利用正交试验极差、方差分析对胡萝卜嗜酸乳杆菌乳酒的制作工艺条件进行优化。在发酵温度37℃条件下其最佳的生产工艺为:发酵时间为4h,接种量为8%(V/V),胡萝卜汁与和鲜牛乳比例为4:6(V/V),白砂糖添加量为9%(W/V),米酒添加量为10%(V/V),可以生产出口感细腻、滑润,酸度适中,凝乳状态良好,有较浓的醇香味,酒精度为0.6%(V/V)左右的胡萝卜嗜酸乳酒。另外,通过实验可以得出40%的胡萝卜汁能加速嗜酸乳杆菌的发酵,3h发酵酸度为92oT,活菌数达109CFU/ml以上。发酵结束后在储藏(4℃以下)过程中,虽然酸度有所增加,但贮藏3d,活菌数在108CFU/ml以上,15d活菌数仍在107CFU/ml以上。

马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)合成开菲尔多糖培养基组成的优化

研究了发酵培养基组成对Lactobacillus kefiranofaciens的菌体生长以及合成开菲尔多糖(Kefiran)的影响。通过比较L. kefiranofaciens利用各种糖类和麦芽汁的发酵情况,发现麦芽汁最利于菌体生长及发酵产糖;各种氮源对L. kefiranofaciens发酵影响不同,其中以酵母粉最好,采用一品鲜酵母粉发酵的最佳浓度为10%;正交实验和RSA方法确定对发酵影响显著的三个无机盐是MnSO4.4H2O、MgSO4.7H2O和KH2PO4,最佳用量为0.2g/L,1g/L,4g/L,此时发酵获得开菲尔多糖产量为2.6±0.05g/L。L. kefiranofaciens发酵生产开菲尔多糖96h时可达到最佳发酵结果。

我国发酵型乳酒的开发研究进展

简介了发酵型乳酒的开发研究类型、特点及营养保健功能,综述了影响其生产的发酵剂(开菲尔粒)和生产工艺等主要因素,并对其进一步开发进行了展望。

乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究

在乳酒酵母原生质体形成率和再生率影响单因素研究的基础上,对菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度、稳渗剂采用L1(6 4)5正交试验,评价各因素的影响程度,得出适宜该菌原生质体制备的条件。结果表明,菌龄12 h、酶浓度1.0%、酶解时间1 h、酶解温度28℃、稳渗剂选用KCl的条件下,原生质体形成率76%,再生率62%。

蒸馏型乳酒的研究

乳酒有诱人的芳香和宜人的口味,且具有丰富的营养,有利于人体健康,但发酵型乳酒在常温下不能久贮,因此发酵型乳酒逐渐演变成了蒸馏型乳酒.从工艺流程、操作要点、质量标准、产品特点等4方面对蒸馏型乳酒的生产工艺进行研究,使乳酒生产从原始自然的生产到工厂阶段的生产有了新的进展.

乳酒的生产技术发展

乳酒是一种低酒度的含乳饮料,乳酒的分类一般按发酵和后处理方式分为发酵乳酒、蒸馏乳酒、勾兑乳酒、起泡乳酒和加气起泡乳酒。文中综述了以乳为原料,生产营养丰富的凝固型酸乳酒、蛋白多肽复合果汁乳酒、蒸馏型乳酒、勾兑乳酒以及起泡乳酒的生产工艺、常用的发酵方法以及乳酒的开发前景。

马乳酒样乳杆菌ZW3基因WANG_1108的特性及功能

为分析马乳酒样乳杆菌ZW3(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3)的一株突变株2#胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)产量下降的原因。对突变株2#进行基因组重测序后与野生菌ZW3全基因组比对,分析突变基因在代谢通路中EPS产量的相关性;利用实时荧光定量-聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术分析可能会与多糖产量相关的突变基因的相对表达量;构建含有表达量变化明显基因的重组质粒转至大肠杆菌并测定其酶活性,探究突变基因与产糖量的关系。结果经全基因组分析比对,野生菌株ZW3与突变株2#在CDS区和启动子区发生突变的基因共60个,其中相关催化反应酶类基因有6个,分别为:WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175(3个基因均为编码二羟丙酮激酶亚基部分)、WANG_0292(β-半乳糖苷酶小亚基)、WANG_0840(UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸连接酶)、WANG_1108(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶),其中WANG_0292发生了同义突变。RT-qPCR分析突变基因相对表达量,发现突变株WANG_1108基因相对表达量下降明显,选取WANG_1108进一步阐明与多糖产量的关系;成功构建重组表达载体pET28a-ZW3/2#-1108、并转至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),诱导蛋白表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳酶活性测定结果显示,突变株中酶活性比野生菌降低了37%。由此推测基因WANG_1108的突变是影响突变株产糖量下降的原因之一。

搅拌型酸乳酒的研制

采用保加利亚杆菌和嗜酸链球菌生产搅拌型酸乳,并在凝乳破碎工序中加入酒以进行酸乳酒的研制。通过对比试验摸索出最佳的生产工艺条件为:牛乳加乳酸菌发酵3.5小时,干红葡萄酒的添加量为7%,0.4%的复合稳定剂。

西藏传统发酵牦牛酸奶中乳酒假丝酵母的分离鉴定与系统发育学分析

目的开发西藏传统发酵牦牛酸奶的微生物种质资源。方法对拉萨周边牧场的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行乳酸菌的分离过程中得到6株酵母菌,通过常规形态特征、生化和基质解吸电离飞行时间质谱法(matrix desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)进行鉴定,对其质谱标识峰进行蛋白质水平同源性分析,采用ITS序列对其进行基因学比对。结果经生化和质谱鉴定分离的6株酵母为乳酒假丝酵母,分离酵母和已知乳酒假丝酵母通过ITS序列在GENEBANK比结果为命名有差异为马克斯克鲁维酵母,但乳酒假丝酵母可认定为其无性型变种。蛋白质同源分析结果表明6株分离菌与已知乳酒假丝酵母在蛋白质水平有一定差异,收集到其特征性蛋白质片段的标识峰12组。结论乳酒假丝酵母的分离与研究为西藏传统发酵牦牛酸奶中酵母菌的开发提供理论支撑。

马奶、牛奶混合发酵生产乳酒

对马奶、牛奶混合发酵进行了探讨性研究,在理论、实践上证实其可行性,并发现马奶、牛奶混合发酵生产乳酒时,牛奶比例以不超过60%为宜。

发酵型乳酒及乳饮料的开发研究进展

随着我国乳品工业的快速发展,发酵型乳酒及其饮料的开发研究不断深化,笔者对近年来我国发酵型乳酒的开发研究类型及营养保健功能进行了归纳总结;综述了影响其生产的发酵剂(开菲尔粒)和生产工艺等主要因素,并对其进一步开发进行了展望。

基于响应面法优化咖啡乳酒发酵工艺

为寻求咖啡乳酒的最佳发酵工艺,以开菲尔菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为发酵剂,咖啡、牛奶、白砂糖为原料进行咖啡乳酒的酿制。在单因素试验的基础上,选取白砂糖添加量、咖啡添加量、酿酒酵母接种量及发酵时间4个因素,以感官评分为响应值,通过响应面法对咖啡乳酒的发酵工艺进行优化。结果表明,咖啡乳酒最优的发酵工艺条件为:白砂糖添加量10.5%、咖啡添加量1.3%、酿酒酵母接种量0.4%、发酵时间3.5 d;在此最优条件下,咖啡乳酒的色泽褐黄透明,咖啡香、奶香与酒香和谐,酒体丰满圆润,感官评分为88.9分。