酒酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的测序及分析

苹果酸乳酸酶是乳酸菌进行苹果酸乳酸发酵(MLF)的关键酶。以携带酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系OenococcusoeniSD2a的苹果酸乳酸酶基因mleA的重组质粒pLmleA作为测序质粒,进行测序分析。测序结果表明,克隆到的mleA基因序列与已报道的序列同源性为99%。mleA基因序列中有2个碱基与报道不同,其中1614碱基的改变导致错意突变,编码的氨基酸由报道的Asp变为Glu,这一改变使得原有的BamHI位点不再存在。

Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。

重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle产苹果酸乳酸酶发酵条件的优化

该研究以实验室构建的重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle为研究对象,以L-乳酸量为评价指标,通过单因素和正交试验研究了诱导温度、培养基起始pH值、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导时间对重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle分泌表达苹果酸乳酸酶(MLE)的影响。结果表明,重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle分泌表达苹乳酶的最佳培养条件为培养基起始pH值为5.9,诱导温度为28℃,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间3 h。在此优化条件下,L-乳酸产量为2.37 g/L,较优化前提高9.48倍。

分泌表达苹果酸乳酸酶的大肠杆菌系统的构建

苹果酸乳酸酶(简称苹乳酶)是果酒生产过程中苹果酸乳酸发酵(简称苹乳发酵)的关键酶。为了构建分泌表达苹乳酶的大肠杆菌表达系统,作者通过融合PCR将信号肽基因(487bp)和苹乳酶基因(1 623bp)的编码序列连接在一起,将融合片段(2110 bp)克隆到表达质粒pET28a(+)上并转化大肠杆菌,得到阳性克隆子。IPTG诱导阳性克隆子后可得到相对分子质量约为60 000左右的蛋白质,利用HPLC可在其发酵上清液中检测到240.7 mg/L的L-乳酸。这说明成功构建了分泌表达苹乳酶的大肠杆菌系统,该菌株的获得将为苹乳酶的研究和应用提供了技术平台。

酒类酒球菌苹果酸乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)基因组中扩增出 6 5 1bp的DNA片段 ,将之克隆到pUC19 T载体上并转化大肠杆菌 (E .coli)JM10 9菌株。重组质粒的测序结果表明 ,克隆到了苹果酸 乳酸酶基因 (mle) ,它含有 5 2 7bp的阅读框架 ,其核苷酸序列与文献报道相同。

固定化乳酸酶膜圈的研究

本文研究了固定化L-乳酸氧化酶膜圈的制作技术及其生化特性,并与美国YSI酶膜圈进行了比较,认为二者具有等值性,可与YSI-23L型乳酸分析仪配套使用。

乳酸乳球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与pGEM-T载体连接构建mle-T载体并转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆(白色菌落),酶切鉴定并测序。SalI酶切mle-T,回收mle DNA片断,与表达载体pET-28a载体连接,构建细菌Escherichia coli表达载体。

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.

苹果酸—乳酸酶基因的研究进展

近年来,随着分子生物学技术的飞速发展和对苹果酸-乳酸酶(MLE)基因的深入研究,使得苹果酸-乳酸工程菌的构建成为可能。简要阐述了国内外对MLE最新的研究进展。

血清乳酸脱氢酶与转移性胃癌预后关系的Meta分析

目的:系统评价血清乳酸脱氢酶(LDH)在转移性胃癌患者预后作用中的价值。方法:计算机检索PubMed、EMbase、The Cochrane Library、CNKI、WanFang Data、VIP和CBM数据库,搜集从建库至2021年9月1日发表的关于LDH对转移性胃癌患者预后影响的国内外文献;由两位研究者独立对文献进行筛选,并提取资料、评价偏移风险后,运用RevMan5.4软件进行Meta分析。结果:共入选8篇文献,累计转移性胃癌患者3139例。Meta分析结果显示,LDH水平升高的转移性胃癌患者的总生存期(OS)短于LDH水平正常患者[HR=1.46,95%CI(1.09,1.96),P=0.01],差异有统计学意义。按照治疗方式、样本量、发表时间、研究区域进行亚组分析,结果显示:在对照组是化疗+手术、样本量≥300、发表时间≥2015、国外的研究中相关性无统计学意义。结论:LDH水平升高可能是转移性胃癌的预后不良因素,检测LDH有助于进行合理的预后评估,可以协助临床决策。

急性B淋巴细胞白血病儿童乳酸脱氢酶、前白蛋白及二者比值与化疗早期疗效的相关性

目的:探讨急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿乳酸脱氢酶(LDH)、前白蛋白(PA)及二者比值(LPR)与化疗早期疗效的相关性。方法:选取2020年5月至2022年5月我院收治的B-ALL患儿126例,观察患儿初诊时(化疗前,T0)、化疗第3 d(T1)、化疗第33 d(T2)的LDH、PA水平及LPR值。按照化疗第33 d微小残留病比例,将患儿分为疗效良好组(n=94)和疗效不良组(n=32),采用logistic回归分析化疗早期疗效的影响因素。结果:T1时患儿LDH及LPR低于T0,且T2低于T1(P<0.05);T2时PA高于T1(P<0.05)。临床危险度为高危、T0-WBC≥100×10~9/L、T0及T2时的LPR较高是患儿化疗早期疗效不良的危险因素(P<0.05)。结论:化疗后,B-ALL患儿LDH及LPR呈逐渐下降趋势,PA呈逐渐上升趋势,LPR与患儿化疗早期疗效具有相关性。

碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶及Gleason分级用于评估低风险转移性激素敏感型前列腺癌预后的价值

目的探究碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)及Gleason分级用于评估低风险转移性激素敏感型前列腺癌(mHSPC)预后的价值,为低风险mHSPC患者的诊疗提供科学参考。方法回顾性分析2015年至2021年丽水市人民医院低风险mHSPC患者,以出现去势抵抗性前列腺癌(CRPC)作为不良预后的主要结局指标,将48例出现CRPC的患者纳入观察组,未出现CRPC的48例患者纳入对照组。比较两组患者ALP、LDH和Gleason分级状况,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析ALP、LDH、Gleason分级对mHSPC出现不良预后的预测作用。结果观察组患者ALP和LDH水平明显高于对照组,观察组Gleason分级4~5级患者占比明显高于对照组(P<0.05)。高ALP(≥300 U/L)、高LDH(≥200 U/L)、高Gleason分级(4~5级)三者联合曲线下面积为0.879,灵敏度为92.1%,特异度为87.6%。结论高ALP、高LDH、高Gleason分级是低风险mHSPC患者发生不良预后的相关因素,联合使用可为低风险mHSPC患者的临床诊治方案提供重要参考。

乳酸脱氢酶/白蛋白对多发性骨髓瘤患者硼替佐米化疗耐药的影响

目的 探讨乳酸脱氢酶(LDH)/白蛋白(ALB)对多发性骨髓瘤(MM)患者硼替佐米化疗耐药的影响。方法 回顾性分析商丘市第一人民医院2021年5月至2023年5月收治的124例MM患者的临床资料。所有患者均已接受4个周期的硼替佐米联合地塞米松化疗。依据MM疗效评价标准评定化疗耐药情况,将发生耐药患者资料纳入发生组(16例),未发生耐药患者资料纳入未发生组(108例)。比较两组性别、Durie-Salmon分期、MM病程等一般资料;比较化疗前测得的LDH、ALB及其他实验室指标,并计算LDH/ALB值。通过受试者工作特征(ROC)曲线和点二列相关性分析探讨LDH/ALB对MM患者硼替佐米化疗耐药的影响。结果 发生组Ⅲ期占比、LDH、LDH/ALB高于未发生组,ALB低于未发生组,差异有统计学意义(P<0.05)。经点二列相关性分析显示,LDH/ALB、LDH、ALB与MM患者硼替佐米化疗耐药发生有关(P<0.05)。绘制ROC曲线,结果显示,LDH、ALB、LDH/ALB预测MM患者硼替佐米化疗耐药发生的曲线下面积值分别为0.791、0.780、0.849,LDH/ALB预测价值最高。结论 LDH/ALB可对MM患者硼替佐米化疗耐药产生影响,其值越高,化疗耐药发生率越高。

血清乳酸脱氢酶、β2微球蛋白、铁蛋白联合改良WHO预后积分系统预测骨髓增生异常综合征预后不良的价值

目的探讨血清乳酸脱氢酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、铁蛋白(SF)联合改良WHO预后积分系统(WPSS)评分对骨髓增生异常综合征(MDS)预后不良的预测价值。方法选取110例MDS患者作为研究对象,均检测血清LDH、β2-MG、SF水平。根据生存情况将患者分为病死组与存活组,比较2组血清LDH、β2-MG、SF水平和改良WPSS评分。分析MDS预后不良的危险因素及血清LDH、β2-MG、SF水平和改良WPSS评分单独及联合对MDS预后不良的预测价值。结果MDS预后不良发生率为40.20%(41/102)。病死组血清LDH、β2-MG、SF、改良WPSS评分和染色体核型预后不良比率均高于存活组,差异有统计学意义(P<0.05)。Cox回归模型分析结果显示,血清LDH、β2-MG、SF水平和改良WPSS评分升高、染色体核型预后不良是MDS预后不良的危险因素(P<0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,血清LDH、β2-MG、SF水平联合改良WPSS评分预测MDS预后不良的灵敏度和曲线下面积(AUC)分别为95.12%、0.918,均显著高于各指标单独预测(P<0.05)。结论血清LDH、β2-MG、SF水平和改良WPSS评分对MDS预后不良均具有一定的预测价值,但4项指标联合预测价值更高。

H型高血压合并冠心病患者24h动态血压变异系数及乳酸脱氢酶水平与冠状动脉粥样硬化病变程度的相关性

目的 探究H型高血压合并冠心病患者24 h动态血压变异系数及乳酸脱氢酶(LDH)水平与冠状动脉粥样硬化病变程度的相关性。方法 对40例H型高血压合并冠心病患者进行冠状动脉造影检查,以Gensini积分表示冠状动脉粥样硬化病变严重程度,以酶联免疫吸附法检测患者LDH水平,监测患者24 h动态血压,计算24 h动态血压变异系数。比较不同冠状动脉病变程度患者24 h动态血压变异系数及LDH水平。24 h动态血压变异系数及LDH水平与动脉粥样硬化病变程度的相关性采用Pearson相关分析,对重度冠状动脉粥样硬化的影响因素行多因素Logistic回归分析。结果 入组冠状动脉粥样硬化轻度病变患者12例,中度和重度病变患者各14例。重度及中度病变患者血清同型半胱氨酸(Hcy)、LDH水平及24 h血压变异系数均高于轻度病变患者(P<0.01),重度病变患者血清Hcy、LDH水平及24 h血压变异系数均高于中度病变患者(P<0.01)。Pearson相关分析显示,血压变异系数、LDH水平与Gensini积分均呈正相关(P<0.05或0.01)。多因素Logistic回归分析显示,24h血压变异系数(OR=1.326,95%CI为1.040~1.691,P<0.05)及LDH水平(OR=1.311,95%CI为1.048~1.639,P<0.05)为重度冠状动脉粥样硬化发生的危险因素。结论 H型高血压合并冠心病患者24 h动态血压变异系数及LDH水平较高,且可能与冠状动脉粥样硬化病变程度加重有关。

磁共振成像联合脑脊液乳酸脱氢酶和C-反应蛋白检测对新生儿化脓性脑膜炎临床诊疗的影响

目的 分析磁共振成像(MRI)联合脑脊液乳酸脱氢酶(LDH)和C-反应蛋白(CRP)检测对新生儿化脓性脑膜炎临床诊疗的影响。方法 将2020年6月—2023年5月在莆田学院附属医院就诊的30例新生儿化脓性脑膜炎患儿纳入观察组,同期30例非中枢神经系统感染(包括新生儿窒息和新生儿缺氧缺血性脑病)患儿纳入对照组。所有患儿均进行MRI检查,比较两组的异常率。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算ROC曲线下面积(AUC),考察MRI联合脑脊液LDH和CRP检测对新生儿化脓性脑膜炎的诊断效能。结果 观察组MRI异常率显著高于对照组(100.00%比36.67%,P <0.05),脑脊液LDH和CRP水平均显著高于对照组,差异均有统计学意义[LDH(U/L):41.57±4.80比37.55±4.49;CRP(mg/L):7.83±2.49比5.27±1.68;均P <0.05]。ROC曲线分析表明,MRI、脑脊液LDH、CRP诊断新生儿化脓性脑膜炎的AUC分别为0.817[95%可信区间(95%CI)为0.703~0.931]、0.737(95%CI为0.609~0.866)、0.793(95%CI为0.676~0.909),均有一定诊断价值,各指标联合检测的AUC为0.843(95%CI为0.744~0.943),诊断价值比各指标单独应用更高。结论 MRI联合脑脊液LDH与CRP检测对新生儿化脓性脑膜炎具有较高的诊断价值,能有效指导临床诊疗。

基于乳酸脱氢酶建立上皮性卵巢癌铂耐药复发预测模型

目的构建预测上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)铂耐药复发的风险模型。方法回顾性分析2012年1月1日至2022年6月30日在云南省肿瘤医院行手术治疗的1392例EOC患者的临床病理资料。对可能影响铂耐药复发的16个因素进行单因素和多因素logistic回归分析并构建logistic回归预测模型。采用加强Bootstrap法对模型进行内部验证。模型表现通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积(area under the curve,AUC)、敏感度、特异度和Brier得分评价,并将模型可视化为列线图和网页计算器。结果多因素logistic回归分析显示,血清乳酸脱氢酶水平、国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期、术后化疗周期和血小板计数均是影响EOC铂耐药复发的独立影响因素(均P<0.05)。基于年龄和上述变量构建的logistic回归模型的AUC、敏感度和特异度分别为0.704、62.0%和68.4%。模型在内部验证中的Brier得分为0.002。结论基于乳酸脱氢酶开发的预测EOC患者铂耐药复发的列线图可用于指导临床实践。

水稻乙酰乳酸合酶Ala179Val突变赋予ALS抑制剂类除草剂广谱抗性

为了鉴定新型水稻突变体ALS179对乙酰乳酸合酶(ALS,acetolactate synthase)抑制剂类除草剂的抗性,本研究以野生型水稻华航31(HH31)、耐咪唑啉酮除草剂水稻ALS627突变体和甲基磺酸乙酯(EMS,ethyl methyl sulfone)诱变的新型水稻突变体ALS179为试验材料,通过不同浓度下的4类乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂包衣浸种和苗期喷施处理,进一步测定表型及相关酶活性指标来探究突变体ALS179的抗性。结果表明,经过除草剂包衣浸种以及苗期喷施处理后,突变体ALS179对苯磺隆、咪唑乙烟酸、双草醚及啶磺草胺具有不同程度的抗性,且乙酰乳酸合酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性随除草剂浓度的升高呈下降趋势。除了20×,30×的咪唑乙烟酸处理条件下过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性低于野生型HH31外,其他处理条件下ALS179的乙酰乳酸合酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性均高于野生型HH31。因此,本研究发现Ala179Val突变赋予了对ALS抑制剂类除草剂的广谱抗性,为后续ALS类除草剂广谱抗性水稻品系的培育提供遗传种质资源。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。