高原牦牛乳铁蛋白素基因克隆及序列分析

利用PCR技术从高原牦牛基因组DNA中获得了乳铁蛋白素(lactoferricin,Lfcin)基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将高原牦牛与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行分析。结果表明:克隆获得了含高原环湖牦牛LF(lactoferrin)第2外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛这一序列存在9个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性。

不同来源乳铁蛋白及乳铁蛋白素对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的比较

以牛乳清乳铁蛋白(bovine whey lactoferrin,LFW)、牛初乳乳铁蛋白(bovine colostrum lactoferrin,LFC)、人乳铁蛋白(human lactoferrin,LFH)、牛乳铁蛋白素(bovine lactoferricin,Lfcin B)和人乳铁蛋白素(human lactoferricin,Lfcin H)为研究对象,研究其对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响并比较不同来源乳铁蛋白(lactoferrin,LF)及乳铁蛋白素(lactoferricin,Lfcin)作用效果的差异性。采用CCK-8法检测不同来源的LF与Lfcin作用小鼠脾淋巴细胞24、48、72 h后,及其与丝裂原共同作用对小鼠T、B淋巴细胞增殖作用的影响。结果显示:LF与Lfcin均在48 h时对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进效果最好,且在一定质量浓度范围内促进效果随质量浓度升高而加强;LF与Lfcin均在一定质量浓度范围内提高刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞的增殖和脂多糖诱导的B淋巴细胞的增殖。结果表明:两种牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin,LFB)及Lfcin B可替代LFH应用于婴幼儿配方产品中以提高婴幼儿免疫能力,LFB推荐添加质量浓度为0.50~2.00 mg/m L,Lfcin推荐添加质量浓度为75~125μg/m L。

牛乳铁蛋白素及其衍生物的研究进展

牛乳铁蛋白素是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解后释放出来的一段小肽,是牛乳铁蛋白的活性中心。通过对不同动物来源乳铁蛋白素活性的研究发现牛乳铁蛋白素的抗菌活性最强。进一步的丙氨酸突变实验研究表明,在牛乳铁蛋白素活性最强的15个氨基酸序列中,色氨酸在抗菌过程中起着重要作用。牛乳铁蛋白素正是因为含有两个色氨酸,其活性才会比只含有一个色氨酸的其它来源的乳铁蛋白素活性要高。很多实验室围绕着牛乳铁蛋白素中的色氨酸、碱性氨基酸和其他一些芳香族氨基酸展开了一系列的突变研究,本文综述了这些研究及在氨基酸改变后活性的变化,为以后研究及开发牛乳铁蛋白素提供理论基础。

牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12)杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

为了构建新型的杂合肽,设计了一种新型杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素（1-15）-蜂毒素（5-12）,由牛乳铁蛋白素（LfcinB）N端第1~15个氨基酸残基和蜂毒素（Melittin）N端第5~12个氨基酸残基组成。根据大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成了杂合肽LfcinB（1-15）-Melittin（5-12）的基因片段,插入到表达载体pET-32a的NcoI和SalI的酶切位点之间,构建重组表达质粒。重组表达质粒转化到Escherichia coli BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,融合蛋白以可溶形式在Escherichia coli BL21（DE3）中获得成功表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上,每升培养物可获得35mg融合蛋白。带His标签的融合蛋白经His-Bind纯化试剂盒纯化、肠激酶切割和抑菌实验表明,杂合肽具有明显的抑菌效果。这为利用基因工程方法生产抗菌肽奠定了理论基础。

不同来源Lfcin对小鼠脾淋巴细胞增殖及分泌细胞因子影响的对比研究

本文以牛乳铁蛋白素Lfcin B和人乳铁蛋白素Lfcin H为研究对象,研究其对小鼠脾淋巴细胞增殖及分泌细胞因子的影响并比较两者的差异及相关性。采用CCK-8法检测不同浓度的Lfcin单独作用对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及不同质量浓度Lfcin与丝裂原共同作用对小鼠T、B淋巴细胞增殖作用的影响;ELISA法测定IL-2、IL-4和TNF-α的含量。结果显示:Lfcin B和Lfcin H能显著促进脾淋巴细胞增殖及增强Con A诱导的T淋巴细胞的增殖和LPS诱导的B淋巴细胞的增殖,并且能显著促进脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、TNF-α(P<0.01)。研究结果表明:Lfcin能有效的促进脾淋巴细胞的增殖,并与Con A、LPS对T、B淋巴细胞的增殖有协同刺激作用,其机制可能是通过促进细胞因子的分泌发挥免疫增强作用。

不同来源Lfcin诱导Jurkat细胞凋亡的对比研究

本文以牛乳铁蛋白素LfcinB和人乳铁蛋白素LfcinH为研究对象,研究其通过降低线粒体膜电位抑制Jurkat细胞增殖效果及两者的差异性。采用MTT法检测LfcinB和LfcinH对Jurkat细胞增殖影响;Hoechst33258染色法荧光显微镜观察Jurkat细胞核的变化;运用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术将LfcinB和LfcinH促进Jurkat细胞凋亡的阶段进行区分;JC-1染色激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位的改变。结果显示:LfcinH和LfcinB对Jurkat细胞有显著的抑制作用(P<0.05),呈剂量依赖性;经LfcinB和LfcinH处理后的Jurkat细胞在荧光显微镜下均可见细胞核皱缩、碎裂呈凋亡特征;激光共聚焦显微镜观察到Jurkat细胞线粒体膜电位下降;流式细胞术检测发现Jurkat细胞经LfcinB和LfcinH处理48 h时主要发生早期凋亡。研究结果表明:Jurkat细胞凋亡的机制可能是通过影响线粒体膜电位导致Jurkat细胞凋亡并抑制细胞增殖;当两者浓度小于250μg/mL时LfcinH对Jurkat细胞抑制效果较强,浓度大于250μg/mL时两者对Jurkat细胞抑制效果相近。