生物复合材料体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞分析

目的探讨生物复合材料HA-玻璃涂层/多孔ZrO2体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞的能力,找到骨髓间充质干细胞理想的复合载体及移植后的安全性,为骨缺损的临床快速恢复治疗奠定基础。方法通过生物材料体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞,培养至14天、21天,经Gomori钙钴法染色、Von Kossa染色及Ⅰ型胶原免疫组化分析比较诱导前后其碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原的表达变化;流式细胞技术检测诱导前后细胞CD45、CD44及CD90的表达变化。结果 SD大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导14天,出现了三角形或不规则细胞,细胞之间界限清晰,碱性磷酸酶呈阳性表达;诱导至21天,细胞中出现致密圆形的矿化结节及Ⅰ型胶原呈阳性表达,细胞之间界限模糊;流式技术检测诱导前后细胞表面CD44仍为阳性表达,CD45仍为阴性表达,而CD90由原来的阳性表达转为阴性表达,细胞表达阳性率由99.7%下降为0.29%。结论该生物复合材料将骨髓间充质干细胞成功诱导为成骨细胞,且该材料又能与骨形成很强的化学结合,用作骨缺损的填充材料,为新骨的形成提供支架,发挥骨传导作用。

血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞表达胰岛样细胞基因效果观察

目的观察血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞(MSC)表达胰岛样细胞基因的效果。方法 SD乳鼠10只,手术分离胫骨和股骨,分离、培养MSC,分别采用5%(对照组)、10%(低浓度组)和20%(高浓度组)的胎牛血清(FBS)刺激。纯化至第4代时以MTT法检测MSC增殖趋势;诱导14 d时用RT-PCR检测MSC细胞中的巢素蛋白(Nestin)、胰十二指肠同源性盒因子-1(PDX-1)、Insulin mRNA,用免疫荧光法检测Nestin、PDX-1、Insulin蛋白。结果随着血清浓度增高与刺激时间延长,MSC呈现明显的增殖趋势,细胞形态发生改变,形成胰岛β细胞轮廓。高浓度组MSC Nestin mRNA表达低于对照组,PDX-1、Insulin mRNA表达高于对照组(P均<0.05)。诱导14 d时Insulin、Nestin、PDX-1蛋白表达与7d时比较,P均<0.05。结论血清诱导下乳鼠MSC中胰岛相关基因PDX-1、Insulin表达上调,Nestin表达减少,显示MSC在一定条件下可被定向诱导分化成胰岛样细胞。

SD乳鼠骨髓间充质干细胞体外改良筛选法培养及鉴定

目的评估应用SD乳鼠骨髓的改良筛选法分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)的可行性及优势,探讨一种简单高效的BMSCs体外分离、纯化及扩增的方法。方法选择7d龄SD大鼠6只,无菌解剖大鼠双侧股骨,于完全培养基浸泡、剪碎,反复吹打暴露骨髓腔,高速震荡3min后取上清液接种于培养瓶中,24h后半量换液,48h后全量换液,以后隔天换液。应用CCK-8法测定生长曲线;成骨分化诱导3周后进行茜素红染色,成脂分化诱导4周后进行油红“O”染色;应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。结果原代培养的BMSCs细胞生长曲线呈“S”形,接种1d后有少量细胞贴壁,第3~6天为对数增殖期,第7天进入平台期。BMSCs经成骨诱导3周后茜素红染色细胞外基质中可见深红色团块状矿化结节;经成脂肪诱导4周后胞浆内充满“串珠状”红色脂滴。流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD44、CD90阳性,CD34和CD45阴性。结论应用7d龄SD乳鼠的改良全骨髓自然贴壁筛选法可以高效分离纯化出BMSCs。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的探讨MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖、凋亡和迁移的影响及分子机制。方法正常环境下培养的BMSC为对照组,以MCF-7细胞条件培养基培养的BMSC为MCF-7条件培养基组,向MCF-7条件培养基组添加10 nmol/L GSK690693(Akt抑制剂)为Akt抑制剂组,向MCF-7条件培养基组添加10µmol/L Reparixin(CXCR1/2抑制剂)为CXCR1/2抑制剂组。MTT实验检测各组BMSC增殖情况,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组BMSC凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测各组BMSC的迁移能力,酶联免疫吸附试验检测两种细胞培养上清液和MCF-7细胞条件培养基中白细胞介素(IL)-8蛋白含量,Western blot检测各组BMSC的蛋白激酶B(Akt)/磷酸化Akt(p-Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达。结果与对照组相比,MCF-7条件培养基组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与MCF-7条件培养基组相比,CXCR1/2抑制剂组和Akt抑制剂组BMSC的细胞增殖水平、迁移数目以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,细胞凋亡率增加(P<0.05);MCF-7细胞条件培养基和MCF-7培养上清液中IL-8蛋白含量均较BMSC培养上清液中IL-8蛋白含量高(P<0.05)。结论MCF-7细胞条件培养基通过激活Akt-mTOR信号通路促进BMSC增殖和迁移,抑制BMSC凋亡,其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

背景:间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果,但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。目的:探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。方法:取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,按浓度梯度0,20,40,80,160μmol/L加入芒果苷孵育2 h,然后加入含400μmol/L H_(2)O_(2)的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h,以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况,按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。结果与结论:与正常对照组相比,H_(2)O_(2)组细胞的存活能力显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平显著升高(P<0.01);与H_(2)O_(2)组相比,芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P<0.01),丙二醛水平显著降低(P<0.01)。芒果苷在20μmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性,且在160μmol/L以下无细胞毒性。结果表明,抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性,为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:小分子药物TD-198946是一种能诱导干细胞形成软骨的高效软骨生成剂,但目前尚不清楚其对成骨分化的作用。目的:探讨小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果及其作用机制。方法:提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用CCK-8法评估不同浓度TD-198946对骨髓间充质干细胞增殖的影响,确定TD-198946的最佳使用浓度;然后加入最适浓度TD-198946和成骨分化培养基对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导;成骨诱导第3天用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原基因表达;成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色,Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达;成骨诱导第21天进行茜素红染色。结果与结论:①CCK-8实验结果显示,100 nmol/L TD-198946能促进骨髓间充质干细胞增殖;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,TD-198946能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化;③qRT-PCR结果显示,TD-198946可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达;④Western blot结果显示,TD-198946可促进Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原以及p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果表明,小分子药物TD-198946可能通过激活PI3K/AKT信号通路,诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。

骨髓间充质干细胞对骨关节炎大鼠软骨损伤的影响及机制研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对骨关节炎(OA)大鼠软骨损伤的影响及其机制。方法大鼠膝关节腔内注射木瓜蛋白酶构建OA模型,将构建成功的20只OA大鼠按照随机数字表法分为OA组和治疗组,每组10只;同时将膝关节腔内注射等量生理盐水的10只大鼠作为对照组。HE染色观察大鼠膝关节软骨损伤,Mankin's评分法评估膝关节软骨病理损伤程度,缚线法检测大鼠膝关节肿胀度,医用测角尺检测大鼠膝关节被动活动度,流式细胞仪检测大鼠脾脏辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)比例,生化试剂盒检测大鼠血清中白细胞介素-17(IL-17)含量和软骨组织中丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法检测软骨组织中乳酸脱氢酶A(LDHA)、己糖激酶2(HK2)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达水平。结果与对照组比较,OA组和治疗组大鼠膝关节软骨组织Mankin's评分、膝关节肿胀度、Th17细胞比例、Th17/Treg比值、血清IL-17含量和软骨组织中Fe2+含量、MDA含量及LDHA、HK2、PKM2、ACSL4蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);膝关节被动活动度、Treg细胞比例和软骨组织中GPX4蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与OA组比较,治疗组大鼠膝关节软骨组织Mankin's评分、膝关节肿胀度、Th17细胞比例、Th17/Treg比值、血清IL-17含量和软骨组织中Fe2+含量、MDA含量及LDHA、HK2、PKM2、ACSL4蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);膝关节被动活动度、Treg细胞比例和软骨组织中GPX4蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论BMSCs治疗可明显改善OA大鼠软骨损伤,其作用机制可能与改善Th17/Treg细胞平衡和软骨糖酵解、铁死亡有关。

透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善心肌梗死大鼠的心功能(Ⅲ)

背景:作者前期的研究结果显示透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞显著改善大鼠心肌梗死后心功能。目的:探索透明质酸水凝胶及骨髓间充质干细胞促进心肌修复的分子机制。方法:分离培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,然后用透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞在培养皿中进行体外三维培养。结扎雌性SD大鼠左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,1周后行超声检测,将符合条件的大鼠随机分为4组:①PBS组(n=12);②透明质酸组(n=12);③骨髓间充质干细胞组(n=15);④骨髓间充质干细胞+透明质酸组(n=15)。造模1周后将模型鼠行二次开胸,按照分组将PBS、透明质酸水凝胶、骨髓间充质干细胞、透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞注射到梗死边缘区及梗死区。移植后1 d、1周、2周,Western blot检测梗死区域及周边的基质金属蛋白酶2、血管内皮生长因子、胸腺素β4以及c-Kit的蛋白表达水平,移植后2周免疫荧光检测移植细胞的分化情况。结果与结论:①在移植后1周时,骨髓间充质干细胞组的基质金属蛋白酶2及血管内皮生长因子蛋白表达水平明显高于其他3组(P<0.05);在移植后2周时,透明质酸组的基质金属蛋白酶2及血管内皮生长因子的表达水平明显低于其他3组(P<0.05),但骨髓间充质干细胞+透明质酸组的基质金属蛋白酶2及血管内皮生长因子表达水平与骨髓间充质干细胞组相比无差异,这可能反映了透明质酸水凝胶对骨髓间充质干细胞分泌的因子起到缓释作用以至于移植细胞的旁分泌效应得到延长,这种延长的旁分泌效应抵消了2周时透明质酸水凝胶引发的抑制效应;②与PBS组相比,透明质酸组、骨髓间充质干细胞组及骨髓间充质干细胞+透明质酸组的胸腺素β4及c-Kit表达水平明显升高(P<0.05);③移植后2周未检测到移植细胞向心肌细胞或血管分化;④提示:移植的骨髓间充质干细胞是通过旁分泌作用促进心肌修复,透明质酸水凝胶延长了移植骨髓间充质干细胞的旁分泌作用。

微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制

目的探讨两种形状微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成骨分化的影响及机制。方法利用q RT-PCR技术检测三角形和圆形微图案化表面上r BMSCs成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn和成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2的表达情况,利用免疫荧光和q RT-PCR技术检测三角形微图案化表面上Piezo1、F-actin、Myosin和YAP的表达情况。结果三角形微图案化表面上r BMSCs的成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn的表达均升高,且边长为15μm时表达最强,而成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2表达均降低。在圆形微图案化表面,r BMSCs的成骨和成脂基因表达均下调。此外,在15μm三角形微图案化表面上,r BMSCs的Piezo1、F-actin、Myosin和YAP表达均升高。通过使用Piezo1抑制剂Dooku1处理,观察到这些蛋白的表达均降低,且细胞的成骨能力受到抑制。结论三角形微图案化表面能够显著促进r BMSCs的成骨分化,尤其是在边长为15μm时效果最为显著。该表面通过Piezo1信号通路促进r BMSCs成骨分化,涉及的关键信号分子包括Piezo1、F-actin、Myosin和YAP。

高糖环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor-1,PD-1)在高糖环境下影响骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制尚不清楚。目的:探讨高糖环境中PD-1对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其调控机制。方法:将大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、PD-1过表达组、PD-1过表达空载组、PD-1敲低组、PD-1敲低空载组、PI3K/AKT通路抑制剂组(PD-1敲低+5μmol/L LY294002)。通过在高糖培养基中培养大鼠骨髓间充质干细胞来模拟体外糖尿病环境,采用qRT-PCR检测大鼠骨髓间充质干细胞中PD-1及其配体PD-L1和成骨标志物Runx2、OSX的mRNA表达,采用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色观察成骨分化能力,采用CCK-8检测细胞增殖情况,采用Western blot检测PD-1、PD-L1、p-PI3K、p-AKT的蛋白表达。结果与结论:①高糖组PD-1及PD-L1表达显著高于正常糖组,高糖组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力较正常糖组显著下降;②敲低PD-1表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、增加细胞增殖活性,同时激活PI3K/AKT通路;③加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,骨髓间充质干细胞成骨分化能力显著下降。结果表明:PD-1依赖于PI3K/AKT信号通路抑制高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

运动预处理联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

背景:干细胞疗法在改善心肌梗死后心脏重构方面具有广阔前景,但心肌微环境改变影响干细胞疗效。运动预处理类似于缺血预处理,能够对心肌产生保护作用。然而,运动预处理与干细胞移植联合作用的效果与机制鲜有关注。目的:观察运动预处理对心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞移植效果的影响,探讨局部炎症微环境在其中的作用机制。方法:80只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、移植组和联合组,每组20只。利用结扎冠状动脉左前降支的方法制作心肌梗死大鼠模型,假手术组仅穿线不结扎。移植组和联合组造模后于心肌内注射雄性大鼠来源骨髓间充质干细胞,此外,联合组在造模前还需进行8周跑台运动(即运动预处理)。干细胞移植后4周,采用递增负荷运动力竭实验测定运动能力,超声心动术测定心脏结构与功能,压力容积导管法检测左心室血液动力学,原位染色法进行心肌组织病理学观察并获取心肌胶原容积分数。干细胞移植后1,7 d和4周,采用定量反转录聚合酶链反应检测左心室促炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、抗炎症因子(白细胞介素10)、Y染色体性别决定区和胚胎基因(心房钠尿肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链)m RNA表达量。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数降低(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数增加(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量上调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量下调(P <0.05)。与模型组比较,移植组运动能力、左心室射血分数增加(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数下降(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量下调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量无显著性变化(P> 0.05)。与移植组比较,联合组上述各指标均进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1,7d:与移植组比较,联合组Y染色体性别决定区m RNA表达量升高(P<0.05)。(3)相关分析显示,白细胞介素1β、白细胞介素6(除移植后1 d)、肿瘤坏死因子α与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈负相关(P <0.05),白细胞介素10与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈正相关(P <0.05)。结果表明:运动预处理能够增强骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果,表现为心脏重构得到抑制、心功能进一步提升,其机制与心肌炎症微环境改善促进骨髓间充质干细胞滞留和存活有关。

MYSM1对大鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

背景去泛素化酶能够调控骨骼生长发育,MYSM1基因缺失会造成全身骨骼疏松,当前并无MYSM1对颌骨发育影响的研究。目的探讨MYSM1对颌骨来源的骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法分离10只8周Wistar大鼠下颌骨,利用组织消化法分离培养颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)。取生长良好的第3~5代JBMMSCs进行成骨诱导,利用qPCR、Western blot技术检测成骨标志物OCN、Runx2、ALP及去泛素化酶MYSM1的变化。分别利用空转染慢病毒和MYSM1敲低的慢病毒转染JBMMSCs,设置对照组和敲低组细胞,qPCR检测敲低效率。CCK-8、细胞克隆形成实验检测其敲低MYSM1对细胞的增殖能力影响,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。空转染慢病毒和敲低MYSM1的JBMMSCs成骨诱导7 d后利用qPCR技术、ALP、茜素红染色检测成骨的表达变化。结果JBMMSCs成骨诱导成功后,MYSM1的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。CCK-8显示对照组和敲低组的细胞增殖能力无统计学差异(P>0.05),两组间细胞集落形成实验和细胞迁移能力有统计学差异(P<0.05)。敲低组JBMMSCs在成骨诱导7 d后OCN、Runx2、ALP的mRNA表达水平降低(P<0.05),ALP、茜素红染色浅于对照组。结论敲低MYSM1并未对JBMMSs的增殖和迁移能力造成显著影响,而敲低MYSM1的JBMMSCs成骨分化能力降低。

骨髓间充质干细胞外泌体通过PI3K/Akt通路修复大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞外泌体(exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs-Exos)通过PI3K/Akt通路修复皮瓣缺血再灌注损伤的机制。方法培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),提取细胞上清液中的外泌体并通过电镜、粒径分析及免疫印迹实验进行鉴定。建立以腹壁浅动静脉为血管蒂的大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤模型;将大鼠随机分为4组:Sham组、IR+PBS组、IR+Exo组及IR+Exo+LY组。术后观察并拍照记录大鼠皮瓣大体情况,第7天计算皮瓣坏死区比例;获取大鼠皮瓣组织样本,HE染色和组织评分评估皮瓣组织损伤程度,免疫组化评估皮瓣p-Akt、VEGFA表达水平和CD34标记的微血管密度。结果相比Sham组,IR+PBS组皮瓣坏死区比例增加,组织结构破坏加重,p-Akt及VEGFA表达水平下降,微血管密度降低;IR+Exo组皮瓣坏死和组织破坏水平降低,p-Akt及VEGFA表达上升,微血管密度增加;而PI3K抑制剂降低了BMSCs外泌体的修复作用,表现为皮瓣坏死增加,p-Akt及VEGFA表达下调,微血管密度减少。结论BMSCs外泌体对大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤具有显著的保护和修复作用,PI3K/Akt信号通路可能是BMSCs外泌体治疗皮瓣缺血再灌注损伤的关键通路。

血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

背景:骨髓间充质干细胞是脂肪细胞的来源之一,且表达所有肾素血管紧张素系统成分,但血清血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪组织分化的影响尚不清楚。目的:观察血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的影响,并探究血管紧张素1a型受体敲除对血管紧张素Ⅱ影响骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的作用及可能机制。方法:分离培养野生型SD大鼠及血管紧张素1a型受体敲除SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将其培养至第3代,随机分为4组:野生组,基因敲除组,野生+血管紧张素Ⅱ组,基因敲除+血管紧张素Ⅱ组,在棕色脂肪诱导分化培养基中诱导分化14 d,后2组在每次更换分化培养基的同时加入100 nmol/L血管紧张素Ⅱ进行干预。采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法检测棕色脂肪诱导分化、脂肪分解、β氧化和线粒体生物发生等相关标记物的表达。结果与结论:血管紧张素Ⅱ可抑制骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化,敲除血管紧张素1a型受体基因能够通过促进脂肪分解、增强脂肪酸β氧化、促进线粒体生物发生、增强线粒体功能来改善血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的抑制作用。这些发现为肥胖治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点,揭示了肾素血管紧张素系统在脂肪代谢中的重要作用及其作为治疗目标的潜力。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠相关肺损伤的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMMSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺损伤中ZO-1、Occludin表达的影响。方法将105只雄性SD大鼠随机分成假手术组(SO组)、SAP组和BMMSCs干预组;后两组再按处死时间不同分为6 h、12 h和24 h组,观察各组间肺的病理变化及肺毛细血管通透性改变情况;通过Western blot、RT-PCR检测各组间ZO-1、Occludin蛋白和mRNA的改变情况。结果与SO组相比,SAP组各时间点肺、胰腺的病理改变明显,肺毛细血管的通透性明显增加(P<0.05),肺湿干比值增加(P<0.05),肺ZO-1、Occludin蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05);与SAP组比较,BMMSCs干预组各时间点肺、胰腺的病理改变减轻,肺毛细血管通透性改变减轻,肺组织湿干比值降低,肺ZO-1、Occludin蛋白和mRNA表达升高,12 h和24 h时间点表现的更为明显(P<0.05)。结论BMMSCs可使肺中ZO-1、Occludin的表达增加,这可能在减轻SAP相关肺损伤和改善肺毛细血管通透性方面发挥重要作用。