重组人胸腺素β4二串体蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)。方法:人工合成人Tβ4全长基因,构建Tβ4②基因,并将该基因克隆入载体pET-22b(+)中,转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经疏水作用层析纯化重组Tβ4②蛋白,采用Western印迹鉴定表达产物,并对其进行生物活性检测。结果:表达和纯化了Tβ4②蛋白,重组人Tβ4②在体外可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。结论:重组人Tβ4②具有与化学合成Tβ4相同的功能,并有更高的生物学活性。

Tβ4②蛋白基因工程菌发酵条件的优化研究

通过正交实验对重组胸腺素β4②基因工程菌的发酵条件进行优化。选择温度、接种量、诱导剂浓度和诱导时机4因素,分别在3个水平上进行考察。结果显示影响Tβ4②菌体浓度的主次因素顺序:诱导时机>温度>诱导剂浓度>接种量,影响Tβ4②表达水平的主次因素顺序:诱导时机>接种量>温度>诱导剂浓度,最终确定最佳工艺参数为:诱导时机3 h,温度37℃,IPTG 0. 5 mmol/L,接种量5%,并在5 L发酵罐中进行验证,最终菌体得率为49 g/L,Tβ4②表达量达30%。

重组Tβ4②分离纯化条件的优化及实验室研究工艺的确定

优化重组蛋白Tβ4②的纯化条件,最终获得纯度大于98%的具有生物活性的Tβ4②,为后续研究奠定基础。采用单因素试验,研究裂解液体积、裂菌方法、超声功率、硫酸铵饱和度等对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的裂解方法和硫酸铵饱和度;通过对Tβ4②蛋白理化性质的预测,确定最佳的层析方案。采用1∶7的菌体与裂解液体积比,45%的超声功率或高压匀浆技术,50%的硫酸铵饱和度作为粗提纯的最佳条件,并通过疏水作用层析分离获得了纯度大于98%的重组蛋白。该研究优化了重组蛋白Tβ4②的纯化条件,最终获得了纯度大于98%的重组蛋白,蛋白回收率为(0.26±0.02)%,且与Tβ4单体相比,Tβ4②可以明显促进内皮细胞的迁移。