荧光素二乙酸酯荧光微孔板法在细胞活力测定中的应用

目的评估荧光素二乙酸酯（FDA）微孔板检测法在细胞活力测定中的应用。方法培养板接种细胞,加入FDA孵育一定时间,多功能微板分析仪测定荧光值。评价FDA孵育时间、浓度及其他影响因素对检测精确度的影响,并与四甲基偶氮唑盐（MTT）方法在H2O2损伤及细胞数量的检测方面进行比较。结果随着孵育时间的延长,荧光值与细胞数的相关系数随之增加,27-30 min时可达到0.99。FDA终浓度在10-30μg/ml时,荧光值与细胞数的相关系数较高。在H2O2损伤模型检测中,与四甲基偶氮唑盐相比,FDA在H2O2高浓度时相关性更强。结论 FDA法检测细胞活力稳定可靠,适用于多种条件下的细胞活力检测及药理学研究。

应用荧光素二乙酸脂水解酶活性研究不同绿地土壤微生物活性

为了研究不同绿地土壤微生物活性特征,应用荧光素比色法和碱液吸收滴定法,对郑州市不同绿地的FDA(荧光素二乙酸酯)水解酶活性及微生物呼吸强度进行了分析,结果表明,不同绿地表层土壤FDA水解酶活性由高到低的顺序为:人工林地>人工草灌地>行道绿地(文化路)>行道绿地(诚信路)>隔离带绿地>人工草坪>人工灌木地>花卉绿地;人工林地、人工灌木地随土层深度增加FDA水解酶活性、土壤微生物呼吸强度呈下降趋势;FDA水解酶活性与微生物呼吸强度相关系数(r)为0.939 7,这表明FDA水解酶活性与土壤微生物呼吸强度呈正相关,两者均能反映土壤微生物活性,且荧光素比色法优势在于简单、快速、灵敏,这种方法测定总微生物的活性具有广泛性,故FDA水解酶活性更能反映土壤总微生物的活性。

汉逊酵母活性及活力荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双荧光染色检测方法的建立及应用

目的建立用于检测汉逊酵母活性和活力的荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate,CFDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色法。方法通过单因素试验,优化CFDA的染色时间(5、10、20、40、60、120 min)、工作液浓度(50、100、200、300μmol/L)及PI的染色时间(5、10、15、20、25 min)、工作液浓度(2、10、20、30μmol/L)。采用最适条件检测理论存活率为0、25%、50%、75%和100%的汉逊酵母样品,荧光显微镜下观察荧光信号,ImageJ软件分析灰度值;计数存活及死亡细胞个数,计算实际存活率和实际死亡率。同时分析实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值的相关性。采用建立的CFDA-PI双荧光染色法检测3批汉逊酵母培养物的活性及活力。结果CFDA和PI的最佳染色时间为60和5 min,最佳工作液浓度为200和2μmol/L。不同理论存活率汉逊酵母样品的实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值均具有显著相关性(R^(2)=0.9983~0.9992,P<0.05)。3批汉逊酵母培养物活性及活力3次检测值的CV分别为3.20%~4.03%和1.10%~2.27%。结论成功建立了用于检测汉逊酵母活性和活力的CFDA-PI双荧光染色法,可用于相关研究中汉逊酵母活性和活力的快速检测。

高纯度荧光素钠的制备工艺研究

本文介绍了一种制备高纯度荧光素钠的新工艺。利用荧光素钠盐在DMF中与乙酰氯酰化,得到荧光素二乙酸酯。荧光素二乙酸酯的易结晶性可使杂质得以分离,再经过皂化、酸化、成盐的过程制得高纯度的荧光素钠。与常规工艺比较,该工艺具有产率高、纯化效果好的特点。产品纯度大于99%,产率大于78%。

氢化荧光素二乙酸酯的合成及其在活细胞染色中的应用

目的:合成氢化荧光素二乙酸酯,并用于肿瘤细胞的染色标记。方法:通过锌粉和冰醋酸还原荧光素制备二氢荧光素,再经乙酸酐酰化合成氢化荧光素二乙酸酯。氢化荧光素二乙酸酯对肿瘤细胞进行染色,并与荧光素二乙酸酯的染色结果进行对照。结果:不论是贴壁还是悬浮细胞,当浓度为1.0 mg/L孵育染色5 min时,FHDA可基本标记细胞,背景低,可定量检测细胞的荧光强度。结论:氢化荧光素二乙酸酯可用于肿瘤细胞的荧光标记及活性氧等细胞活性物质的检测。

基于FDA-PI双荧光复染法的茄病镰刀菌孢子活性检测

【目的】茄病镰刀菌(Fusarium solani)孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂,耗时费力,需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光复染法和流式细胞术(flow cytometry,FCM)的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度,建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性,一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例(0、25%、50%、75%、100%)的茄病镰刀菌样品,分析实测死亡率和理论死亡率的相关性;另一方面,经物理、化学和杀菌剂处理后,比较FDA-PI复染法和孢子萌发法的检测结果。【结果】确定了FDA和PI的最佳染色参数,其中PI的最佳工作浓度为3μg·m L-1,最佳染色时间为4℃处理10 min;FDA的最佳工作浓度为100μg·m L-1,最佳染色时间为25℃处理20 min。用该技术检测已知死孢子比例样品,各样品实测孢子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关(R2=0.99,P<0.05)。经物理和化学处理后,FDA-PI复染法测得的孢子死亡率与孢子萌发法测得的孢子萌发率之间也呈显著负相关(R2=0.99,P<0.05)。经杀菌剂处理后,随着药剂浓度增高,对茄病镰刀菌杀灭效果增强。其中,氰胺化钙处理后,FDA-PI复染法和孢子萌发法检测孢子死亡率结果一致;而咯菌腈和多菌灵处理后,FDA-PI复染法检测孢子死亡率略低于孢子萌发法检测结果。【结论】建立了基于FDA-PI复染法和流式细胞术的茄病镰刀菌孢子活性检测技术,该技术可以替代传统的孢子萌发方法,大幅度缩减病原菌活性检测时间,提高检测效率,对植物病原真菌活性检测平台的建立具有重要的参考价值,将其应用于杀菌剂的筛选还需要进一步的深入研究。

不同荧光染料对3种储存温度下血小板的标记效果

目的:研究5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA)、碘代3,3'-二己氧基羰花青[DiOC_(6)(3)]和抗血小板膜糖蛋白(GP)Ibβ抗体衍生物对3种储存温度下血小板的标记效果,以期找出1种受温度因素影响小的血小板荧光标记物。方法:取C57小鼠的全血制备富血小板血浆,分3组(室温组、4℃组和冷冻组)保存。保存24 h后,每组血小板分成3等份,分别用CMFDA、DiOC_(6)(3)以及抗GPIbβ抗体衍生物标记,流式细胞术检测各标记物的阳性率以及平均荧光强度(MFI);同时用流式细胞术检测血小板表面Annexin V和CD62P以评估血小板的凋亡和活化情况。结果:冷冻组血小板的CMFDA和DiOC_(6)(3)的阳性率以及MFI均低于室温组及4℃组。冷冻组血小板的Annexin V和CD62P阳性率均高于室温组和4℃组。抗GPIbβ抗体衍生物对3组血小板标记的阳性率以及MFI无明显差异。结论:CMFDA和DiOC_(6)(3)对冷冻组血小板的标记效果差于室温组和4℃组,考虑与冷冻组血小板的凋亡率和活化率高有关;抗GPIbβ抗体衍生物对3组血小板标记效果无明显差异,可以考虑作为荧光标记物应用于比较室温、4℃和冷冻保存血小板功能的相关实验。

适合海洋微藻活体染色的方法评价

为了评估一种快速简单用以确定海洋微藻细胞活性的技术,针对船舶压载水中常见的3个门类中11种10～50μm单细胞微藻用中性红(NR)、5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA)、荧光素二乙酸酯(FDA)三种染料进行染色,通过光镜和荧光显微镜对染色结果进行测定。结果表明,NR(中性红)是检测本实验中全部海洋微藻藻株细胞活性的最佳染料,染色最佳浓度为1/10 000,染色时间为30min;5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA)、荧光素二乙酸酯(FDA)和双荧光染色对海洋微藻藻株活细胞着色时间短,染色效果明显,但其应用具有局限性,适用于检测本实验中甲藻门(塔玛亚历山大藻、链状亚历山大藻、微小原甲藻、利玛原甲藻、东海原甲藻、米氏凯伦藻)和绿藻门(青岛大扁藻和杜氏盐藻)的活性,染色最佳浓度为5μmol/L FDA+2.5μmol/L CMFDA,染色时间为10min,但不适用于检测硅藻门的细胞活性。因此,中性红更适合检测船舶压载水中微藻活细胞,根据光镜下微藻细胞着色情况而判断细胞活性。

长期施肥土壤的FDA水解酶活性

以长期不同施肥处理土壤为研究对象,运用荧光素二乙酸酯(FDA)为底物,采用分光光度法测定土壤FDA水解酶活性.结果表明:在黑土和棕壤上有机肥配施化肥处理的FDA水解酶活性增幅较大,相对于不施肥处理分别增加68.8%和72.4%,也显著高于单施化肥处理;土壤FDA水解酶活性与土壤微生物量碳具有极显著的正相关关系,在黑土和棕壤中相关系数分别为0.912**和0.871**;FDA水解酶活性能较好地反映微生物活性,可以作为评价土壤微生物量和活性的重要指标;同时,土壤FDA水解酶与参与C、N、P、S等重要养分循环的酶活性关系密切,均达到极显著水平.

流式细胞术检测中性粒细胞产生活性氧方法学探讨

目的：建立用流式细胞术检测人外周血中性粒细胞（polymorphonuclear cells,PMN）产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）的方法。方法：健康人外周全血或用Percoll分离的PMN,加探荧光针双氢罗丹明123（DHR123）或2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作用15 min,再加佛波醇酯（phorbo 12-myristate 13-acetate,PMA）于37℃作用5－90 min后,用流式细胞仪检测PMN内的罗丹明123（rhodamine 123,RHO）或氧化型二氯荧光素（dichlorofluorecin,DCF）的荧光强度,以反映PMN内ROS产生的水平。结果：以DHR123为荧光探针时,PMA刺激全血或分离PMN产生ROS的时间动力学相似,在37℃作用5－60 min ROS量呈递增趋势,且在60 min左右达到峰值,60－90 min时渐下降。以DCFH-DA为荧光探针时,PMA刺激全血PMN产生ROS,在37℃作用5 min时反应生成ROS量达到峰值,随后出现明显递减趋势,而PMA刺激分离PMN产生ROS在5－30 min逐渐增高并在60－90 min达平台期。实验中还发现甲醛试剂可以降低RHO的荧光强度。结论：采用流式细胞术检测PMN产生ROS是一种简便、可靠、稳定的方法。

紫花苜蓿改良盐渍土对土壤微生物活性和养分含量的影响

为探讨干旱地区种植紫花苜蓿改良盐渍土对土壤微生物生物量及其活性和土壤养分的影响,选择河西走廊黑河流域国有临泽农场的草甸盐土荒地作为对照,研究了种植紫花苜蓿2、3、4年后的改土效果。结果表明:与CK相比,连续种植4年后,所测定的土壤化学性质和微生物化学性质指标都发生了极显著(P<0.01)的有利变化,电导率下降5.96 mS.cm-1,pH下降0.25,有机碳增加1.50 g.kg-1,微生物生物量碳增加48.93 mg.kg-1,微生物熵上升0.43%,荧光素二乙酸酯水解率提高10.87μg.g-1.h-1,碱解氮增加17.37 mg.kg-1,速效磷增加2.87 mg.kg-1,速效钾增加44.93 mg.kg-1。相关分析表明,微生物生物量碳、微生物熵、荧光素二乙酸酯水解率、碱解氮、速效磷、速效钾与土壤有机碳之间极显著(P<0.01)正相关,相关系数分别为0.86、0.80、0.87、0.85、0.79、0.80,而与电导率之间极显著(P<0.01)负相关,相关系数分别为-0.83、-0.79、-0.84、-0.86、-0.88、-0.78。研究认为,种植紫花苜蓿对草甸盐土有显著的改良效果,电导率下降,有机碳含量提高,微生物活性增强,速效养分含量增加。

Programmed cell death features in apple suspension cells under low oxygen culture

Suspension-cultured apple fruit cells (Malus pumila Mill. cv. Braeburn) were exposed to a low oxygen atmos-phere to test whether programmed cell death (PCD) has a role in cell dysfunction and death under hypoxic conditions. Pro-toplasts were prepared at various times after low oxygen conditions were established, and viability tested by triple staining with fluorescein diacetate (FDA), propidium iodide (PI) and Hoechst33342 (HO342). DNA breakdown and phosphatidyl-serine exposure on the plasma membrane were observed using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL), and annexin V binding. About 30% of protoplasts from cells after 48 h under low oxygen showed an increased accumulation of HO342, indicating increased membrane permeability. Positive TUNEL and annexin V results were also only obtained with protoplasts from cells under low oxygen. The results suggest that apple cell death under low oxygen is at least partially PCD mediated, and may explain tissue breakdown under controlled atmosphere (low oxygen) conditions in apple fruit.

镁碱度对土壤微生物活性和养分含量的影响

从10个具有不同镁碱化程度的采样点,采集土壤样品30个,测定土样pH、镁碱度、Mg2+/Ca2+、HCO3-+CO32-、钠碱度、有机碳、全氮、微生物生物量碳、荧光素二乙酸酯水解率、速效养分等指标。结果表明,镁碱化盐渍土有机碳、全氮、微生物生物量碳、微生物熵、荧光素二乙酸酯水解率、NH4+-N、NO3--N、速效磷等指标都与镁碱度和Mg2+/Ca2+显著负相关,表明镁碱化会造成土壤有机质含量降低、微生物群落变小、微生物活性下降、全量和速效养分含量偏低,镁碱化是导致土地生产力低下的原因之一。

减少好氧-厌氧废水处理系统剩余污泥的研究——Suguru Takano,et al．The 10th APCChE Congress，Kitakyushu，Japan，2004．A-165

目前，来自废水处理厂的剩余污泥的处理已经成为废水处理过程中的一个严重问题。一般，剩余污泥采用填埋、焚烧、发生沼气等方法处置。这些方法都存在这样或那样的缺点．解决这一问题的根本方法是减少废水处理过程中污泥的产生量。在本研究中，提出了一种减少生物污泥产生量的废水处理系统。在该废水处理系统中的微生物要交替经历好氧、厌氧过程。

百合连作年限对设施土壤理化性质和生物学特性的影响

为探讨连作年限对土壤理化性质和生物学特性的影响,自连作4年、5年、7年和对照(未种植百合)设施采集土样,用实时荧光定量PCR、氯仿熏蒸培养法、二乙酸酯荧光素(FDA)等方法研究了供试土壤细菌真菌数量、氮转化功能基因丰度、微生物生物量碳氮、微生物总酶活性的变化。结果表明:随连作年限增加,土壤pH下降,速效养分和有机质累积;细菌数量和反硝化菌nirS型基因丰度在连作4年时显著低于其他处理,连作7年时均达最大值;真菌数量和反硝化菌nir K型基因有上升的趋势;与对照相比,连作4年、5年和7年设施土壤的AOA基因拷贝数分别降低了99.46%、73.77%、45.20%,而AOB基因拷贝数增加了51.09%、79.11%、112.4%;固氮基因nifH的基因拷贝数显著下降;土壤微生物生物量碳氮含量显著增加,微生物总酶活性呈现先增加后下降的趋势、且在连作5年时达最大值。研究认为,连作年限对土壤微生物活性变化起着关键作用,研究结果为今后开展连作栽培对设施土壤质量影响方面研究奠定了基础。

大气PM_(2.5)中微生物活性的探测

【背景】细颗粒物(PM_(2.5))具有多种毒性效应,长期暴露对机体可造成严重危害。微生物作为PM_(2.5)的重要生物组成成分,目前尚无简单易行地测定PM_(2.5)中微生物活性的方法。【目的】利用小流量采样仪采集细颗粒物PM_(2.5),通过大量的模拟和测试实验,初步建立了一套测定PM_(2.5)中微生物活性水平的荧光素二乙酸酯(FDA)水解法。【方法】使用5L/min的小流量采样仪采集样品40 min,FDA的浓度为200μg/mL,经过1.5 h的暗反应,使用丙酮终止15 min后测定其荧光强度,并计算微生物活性。【结果】利用该方法测得2017年7月大气PM_(2.5)中微生物活性平均水平为0.873ng/m^3荧光素钠;室内空气细颗粒物PM_(2.5)中微生物活性水平为1.110 ng/m^3荧光素钠。【结论】建立了一种有效准确地测定大气颗粒物PM_(2.5)中微生物活性的方法。