基于转录组测序筛选蒙古冰草抗旱相关基因

为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)抗旱相关基因并探究蒙古冰草响应干旱胁迫分子机制,本研究以蒙古冰草为材料进行转录组测序。首先将不同生长期及干旱胁迫处理后的盆栽蒙古冰草组织按照根、茎、叶、花(穗)4类分别进行混样并利用三代全长转录组测序技术建立蒙古冰草转录本参考序列数据库,共获得26027条转录本,包含25578个基因,利用BlastX在KEGG,KOG,Nr,Swissprot等数据库中进行比对注释,共有25453个转录本得到注释。其次利用二代转录组测序技术对干旱胁迫处理前后水培蒙古冰草幼苗进行测序,发现干旱胁迫处理2 h,6 h后与处理前相比分别有2669个,3668个差异表达基因。此外,根据转录组及荧光定量PCR验证结果,发现基因ERF053,ERF055,NAC100,bZIP23,ERF5和NAM-B1在干旱处理后表达量较高且均上调可能是抗旱调控关键基因,为后续蒙古冰草抗旱相关候选基因克隆及功能验证奠定了基础。

转录组测序分析非酒精性脂肪性肝炎早期YAP阳性表达肝细胞的功能学特征

目的基于转录组测序(RNA-Seq), 分析比较非酒精性脂肪性肝炎(NASH)早期小鼠模型中Yes相关蛋白(YAP)阳性肝细胞和YAP阴性肝细胞的差异表达基因(DEGs), 初步了解此类YAP阳性肝细胞的功能学特征。方法蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饲喂C57BL/6小鼠2周构建NASH早期模型, 对照组为正常饮食。肝组织行苏木精-伊红(HE)、天狼星红染色和病理学评分;免疫组织化学(IHC)观察YAP、p-YAP在肝组织的表达。胶原酶灌注联合Percoll密度梯度离心获取活率大于90%的原代肝细胞。进行YAP抗体标记、流式分选获得YAP阳性和YAP阴性肝细胞并进行RNA-Seq。测序结果用GO、KEGG和相互作用网路的分析方法筛选DEGs。RT-PCR验证模型组肝组织中YAP以及部分DEGs的表达水平。两样本均数比较采用独立样本t检验。结果与对照组相比, MCD诱导小鼠2周的HE染色肝组织可见脂肪变(病理评分1.07±0.21), 伴有小叶炎症(病理评分1.13±0.32)和肝细胞气球样变(病理评分0.80±0.20), 天狼星红染色未见明显肝纤维化(病理学评分0.40±0.40)。IHC显示NASH早期的部分肝细胞YAP表达为阳性。RNA-Seq分析, YAP阳性和YAP阴性的肝细胞分别得到Clean reads为49 310 604条、54 820 036条。与YAP阴性肝细胞相比, YAP阳性肝细胞导致5 565个基因差异表达, 包括上调基因1 662个, 下调基因3 903个。上调基因的GO分析显示, 嘌呤三磷酸核苷和三磷酸核苷等线粒体功能相关的代谢过程为显著富集的生物学过程(BP);下调基因分析到显著富集的BP为嗅觉受体相关过程。KEGG分析显示, DEGs富集到292条通路, 氧化磷酸化(OXPHOS)通路为显著富集信号通路。RT-PCR确认炎症因子(白细胞介素-1β、白细胞介素-6)、YAP及其靶基因(Cyr61、Ankrd1)以及OXPHOS通路的Cox5b、Sdhc基因水平显著上调, 与测序结果一致。相互作用网络分析预测到8个关键基因。结论 NASH早期肝细胞代谢水平的变化可能与YAP活性增加有关。

基因表达谱分析非酒精性脂肪肝中细胞色素P450的作用

目的用二代转录组测序（RNA-seq）技术，结合差异基因GO分析、KEGG富集分析，探讨细胞色素（CY）P450在高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝（NAFLD）中的作用。方法高脂饲料（D12492，60％脂肪热量）喂养C57BL／6J小鼠16周构建NAFLD模型，以低脂饲料（D12450B，10％脂肪热量）为对照。实验结束后检测体质量、肝质量及肝脏组织中甘油三酯含量，对肝组织行HE染色及RNA-Seq分析，对差异表达基因进行GO分析、KEGG分析及相互作用网络分析。两样本均数比较采用t检验。结果与对照组相比，模型组小鼠明显肥胖，体质量和肝质量显著高于对照组[（41．41±6．01）g比（28．78±1．79）g，t=6．04，P〈0．01]和[（1．38±0．30）g比（1．08±0．10）g，t=2．89，P〈0．01]；HE染色可见模型组小鼠肝脏发生严重脂肪变性，伴少量炎症细胞浸润，但未见明显的纤维化，模型组肝脏甘油三酯含量显著增高[（0．64±0．01）mg／mg比（0．29±0．06）mg／mg，t=10．11，P=0．041。RNA-seq结果显示高脂饮食导致367个基因差异表达，211个下调，156个上调，其中CYP450基因有19个，占差异表达基因的5％，其中CYP2E1、CYP2C70、CYP3A11、CYP3A25、CYP2D26、CYP4A10、CYP17A1、CYP2810、CYP2C38等参与氧化应激、类固醇激素代谢、脂肪酸代谢、花生四烯酸代谢，以及过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等过程；相互作用网络分析预测发挥连接作用的基因有30个，CYP2E1、CYP2C70在其中发挥核心作用。RT-PCR方法对GYP450基因在组织中进行基因水平验证，实验结果与测序结果一致。结论CYP450通过参与氧化应激，脂肪酸代谢、花生四烯酸代谢，类固醇激素合成等多个途径影响脂质代谢，与非酒精性脂肪肝发病进程密切相关。