基于二次谐波和双光子激发荧光相结合的非线性光学成像技术在医学中的应用

1961年，Franken等使用红宝石激光器发出波长为694nm的激光穿过石英晶体，产生波长为347nm的紫外光，这是最早观察到的光学二次谐波（secondharmonicgeneration，SHG）现象，标志着非线性光学的诞生。1986年，Freund等怛首次将SHG用于老鼠尾腱的胶原纤维成像，

基于双光子激发荧光和二次谐波原理的显微成像技术在皮肤科中的应用

基于双光子激发荧光和二次谐波原理的双光子荧光显微镜(Two-photon fluorescence microscopy,TPM)是近年来生物成像领域最重要的发明之一。这项技术具有许多独特的优点,如激光穿透深度增强、光漂白毒性小和组织光损伤减少等。由于其优异的穿透能力和光学切片能力,TPM是目前在完整组织或活体动物体内以亚细胞分辨率对细胞和器官结构和功能活性进行实时、无创、在体监测强有力的工具,已被广泛应用于生物学和医学等各种领域。在过去的几年里,TPM作为临床研究和皮肤疾病实时检测、诊断和治疗监测的新方法,取得了较多的进展。将这些技术应用到临床研究和实践中需要临床医生了解它们的基本原理、优点和局限性等,本文简要的综述了双光子荧光激发原理、二次谐波原理以及TPM在皮肤病学领域中的应用。

基于双光子激发荧光和二次谐波产生的非线性光谱分辨成像技术用于皮肤瘢痕的研究

病理性瘢痕不但可以导致患者畸形,影响美观,还可引起功能障碍,奇痒,甚至发生癌变。目前对瘢痕的形成机制尚不完全清楚,使得它的预防和治疗一直是困扰皮肤科和整形外科的难题。要从根本上预防和治疗瘢痕,寻求新的方法和技术已经成为创伤修复研究与揭示瘢痕产生、发展等内在规律的关键。以二次谐波产生和多光子激发荧光作为信号源的多光子显微技术,因其对组织微结构的高灵敏度和高空间分辨成像、对生物组织的低杀伤性和成像深度深等特点,而在生物医学领域得到了广泛的应用。通过对瘢痕研究进展的综述,探讨基于双光子激发荧光和二次谐波产生的多光子显微成像技术用于瘢痕研究的关键问题和应用前景。这种技术有望实现在临床医学中通过早期无损探测和实时监测等方式对病理性瘢痕进行预防和治疗,从而解决由于理想的实验动物模型的缺乏而限制人类对病理性瘢痕的临床和实验室的研究进展问题。

二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况

目的:用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况。方法:将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1 h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志,用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度,吸收方式。结果:二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1 h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集,并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层。结论:二次谐波可以更快速,更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维,以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志,具有不受荧光信号干扰的优点。人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。

双光子成像在皮肤科的临床应用进展

双光子显微镜(two-photon microscopy, TPM)是一种基于双光子激发荧光(two-photon microscopy, TPEF)和二次谐波产生(second harmonic generation, SHG)对皮肤组织进行非侵入性光学检测的方法,无需荧光染料,具有更精准成像、穿透组织更深、对细胞和组织的光损伤和光毒性更小等优势,在皮肤科疾病辅助诊断及治疗效果监测等诸多方面具有广泛应用前景。

基于非线性超声的疲劳裂纹检测中二次谐波的激发效率

提出在疲劳裂纹的非线性超声检测中,将二次谐波激发效率作为定量表征疲劳裂纹缺陷的特征参数,并对其理论公式进行了详尽的推导,证明了将二次谐波激发效率作为特征参数对疲劳裂纹缺陷进行定量化是有效的。

多枝[1,3,4]-噁二唑衍生物的双光子吸收和光功率限幅特性

采用非线性透过率法测定了多枝[1,3,4]-噁二唑衍生物的双光子吸收性质.测定了化合物的单光子荧光光谱和双光子荧光光谱,在800 nm波长的激光激发下,9-乙基-3,6-双{5-(4-叔丁基苯基)-[1,3,4]噁二唑-2-苯乙烯基}-咔唑(3)和三-{5-(4-叔丁基苯基)-[1,3,4]噁二唑-2-苯乙烯基-4-苯基}-胺(4)能够发出很强的蓝色和黄绿色双光子上转换荧光,荧光峰分别位于485和547 nm.这些多枝结构化合物的双光子吸收截面较大(数值超过104GM),并具有很强的光限幅效应.多枝分子中重复单元的推拉电子结构和协同效应有效地增强了分子的双光子吸收性质.

植物叶片的消荧光现象

实验观察表明，非生物体有消荧光现象，生物体也有消荧光现象。它是激光与物体表面非线性相互作用的结果。植物叶片的消荧光现象是一个多光子过程，并且荧光消失过程伴随二次谐波产生。荧光消失过程中，荧光能量部分地转换为二次谐波信号，经粗略计算，转换效率大约为２．２％。

X荧光分析系列实验

介绍了能量色散 X射线荧光分析的原理、应用以及用

浅述X射线荧光光谱仪的应用

主要介绍了波长色散X射线荧光光谱分析的原理及其应用。

双光子激发二氢卟吩衍生物的光物理特性

用飞秒脉冲激光,研究了二氢卟吩光敏剂CPD3分子在双光子激发(TPE)下的光物理过程。报道了该分子在四氢呋喃(THF)溶剂中的TPE荧光光谱及其寿命,以及在波长800nm处的双光子吸收(TPA)截面,其中,TPE与单光子激发(OPE)的荧光光谱形状一致,具有相同的荧光发射带,荧光寿命分别为5.1ns和5.7ns;在波长800nm处的TPA截面σ2≈12.5×10-22cm4/GW。本文分析表明:在TPE下,该分子跃迁到激发态S2,经历了无辐射弛豫到达OPE的同一荧光能级,呈现激发Q带所产生的正常的荧光发射;该分子具有大的TPA截面是起源于该分子的刚性平面共轭结构所固有的线性吸收特性和TPA共振增强;CPD3作为光动力治疗(PDT)的光敏剂,又具有长波长的荧光发射、ns级的荧光寿命和大的TPA截面特性,这些双重特性使其有可能成为双光子荧光分子探针,借助于双光子荧光显微和成像技术,在分子水平上揭开PDT光敏药物与细胞器的结合特性和作用靶点等深层次问题。

二次谐波成像技术及其在胶原蛋白研究中的应用

二次谐波成像技术具有空间分辨率高、生物样本无需进行荧光标记、对样本光损伤小且穿透力强等优点,被广泛应用于生物学成像领域。本文介绍了二次谐波成像技术的特性,并对二次谐波成像和双光子荧光成像进行了比较,着重介绍了二次谐波成像技术在胶原蛋白研究及医学研究中的广泛应用。最后展望了二次谐波成像技术在生物成像领域的发展和前景。

非线性光学显微镜观察肝脏纤维化的实验研究

目的:了解非线性光学显微镜在肝纤维化成像及定量分析研究中的地位。方法:分别用前向二次谐波(SGH)及背向双光子荧光(TPEF)对肝脏标本的成纤维胶原(Ⅰ/Ⅲ)和肝细胞浆进行成像,将结果与传统的Masson’s三染色法进行比较。随后用非线性光学显微镜对不同肝纤维化阶段的大鼠肝脏标本成像,并对图像进行统计分析。结果:(1)用二次谐波成像的肝内成纤维胶原分布图较传统的方法更清晰,易于进一步定量分析;(2)双光子荧光信号可以清晰的显示肝细胞形态;(3)非线性光学显微镜得到的肝纤维化图像易于用软件进行定量分析。结论:非线性光学显微镜是研究肝纤维化进程的灵敏、准确、快速、简单、客观的新方法。其对肝纤维化的定量分析具有重要临床意义。

稀土离子荧光探针对3,4—二羟苯丙氨酸的测定及能量传递的研究

本文应用稀土离子Tb(Ⅲ)为荧光探针,提出了选择性测定3,4-二羟苯丙氨酸的荧光分析法。通过研究Tb与3,4-二羟苯丙氨酸的络合发光情况,发现Tb-3,4—二羟苯丙氨酸络合物在激发波长为300 nm时有强的Tb特征荧光。而用上述波长直接激发TbCl^3的水溶液,则不能检测到Tb(Ⅲ)的特征荧光,因而可以应用Tb(Ⅲ)的荧光探针测定3,4—二羟苯丙氨酸。

基于SHG/TPEF检测小鼠肝脏弹性纤维方法的建立

目的建立二次谐波与双光子激发荧光(SHG/TPEF)显微成像技术检测小鼠肝脏弹性纤维的方法。方法将8周龄雄性Col1α1-GFP转基因小鼠随机分为两组,每组5只,分别腹腔注射CCl4和橄榄油12周建立肝纤维化及对照小鼠模型。小鼠处死后获得肝组织并进行肝脏脱细胞处理,基于SHG/TPEF识别肝细胞外基质骨架结构中的胶原纤维和弹性纤维荧光信号。结果肝组织块脱细胞后骨架结构清晰可见,形态改变较小,弹性纤维伴随胶原纤维沉积,定位于汇管区和纤维间隔中;CCl4腹腔注射12周后,与对照组相比,肝组织胶原纤维面积百分比(12.4%vs.4.2%,P<0.001)和弹性纤维面积百分比(2.8%vs.1.7%,P<0.01)均显著升高。结论 SHG/TPEF可用于脱细胞后肝组织弹性纤维成像,较传统方法具有一定优势。

生物组织背向SHG和TPEF的影响因素

由于生物组织的复杂性和多样性,以及样品制备等因素的影响,实验观察到的生物组织的背向二次谐波(second harmonic generation,SHG)和双光子激发荧光(two-photon excitation fluorescence,TPEF)效应的差异较大。以鼠尾组织作为实验对象,共40个切片,分为横向和纵向、HE染色和未染色四组,采用飞秒激光器作为激发光,用双光子激光扫描共焦显微镜(two-photon laser scanning confocal microscope,TPLSCM)观察和分析了样品在不同的制备方式、激发波长、激发功率、扫描深度等条件下的背向SHG和TPEF的变化曲线,讨论和比较了生物组织的背向SHG和TPEF的影响因素以及二者之间的异同,并尝试对实验现象做出了一定的解释。

基于压缩感知的HIFU回波信号降噪研究

由于传统的降噪处理方法很难干净地去除高强度聚焦超声(HIFU)信号中的噪声,提出利用压缩感知(CS)对HIFU回波信号进行降噪。在观测矩阵的设计中将传统的高斯随机观测矩阵改进为稀疏循环结构化矩阵,减少了构造观测矩阵和重构信号的时间。仿真实验表明,与带通滤波器、小波降噪方法和经验模态分解(EMD)降噪方法相比,该方法得到的信号的重构信噪比(RSNR)更高,重构均方差(RMSE)和最大误差(ME)更小。用不同方法对不同温度下获得的HIFU回波信号进行去噪并提取二次谐波激发效率,发现采用该方法得到的二次谐波激发效率曲线方差和波动更小,验证了该降噪方法在实测信号中的优越性。

金属构件疲劳微裂纹非线性超声检测

通过对固体非线性超声传播模型的研究,分析了裂纹静态压力与超声波作用力对裂纹超声非线性响应的影响,建立了反映裂纹区应力-应变非线性关系的弹性接触机制超声非线性响应模型以及反映裂纹闭合状态转换的碰撞接触机制超声非线性响应模型。通过实验研究发现,裂纹尖端区的二次谐波激发效率与裂纹的开口区和闭合区及裂纹最终扩展的极限长度有关。因此,可使用二次谐波激发效率作为定量表征金属试件疲劳微裂纹缺陷的特征参数,实验中使用了自主研制倍频双晶复合换能器,这种倍频双晶复合换能器在工程实际应用中更为方便、实用。

基于倍频双晶复合传感器的构件疲劳微裂纹非线性超声检测

通过对固体中非线性超声传播模型的研究,分析了裂纹静态压力与超声波作用力对裂纹超声非线性响应的影响,在此基础上,建立了反映裂纹区应力-应变非线性关系的弹性接触机制超声非线性响应模型;以及反映裂纹闭合状态转换的碰撞接触机制超声非线性响应模型。基于上述理论,通过实验研究发现裂纹尖端区的二次谐波激发效率与裂纹的开口区和闭合区及裂纹最终扩展的极限长度有关。因此,可使用二次谐波激发效率作为定量表征金属试件疲劳微裂纹缺陷的特征参数,实验中使用了自主研制倍频双晶复合换能器,这种倍频双晶复合换能器在工程实际应用中作在线检测更为方便、实用。

光学成像技术活体评价PAEs促皮损愈合的药效

利用双光子激发荧光成像技术、二次谐波成像技术与毛细血管镜系统,活体评估鹿茸蛋白粗提物给药后创面愈合情况。提取鹿茸中水溶性总蛋白,质谱鉴定其成分。全层切除皮肤制备皮肤创伤模型大鼠,于给药10 d后活体观测创面表皮厚度、真皮胶原纤维的含量情况及毛细血管的生长情况。结果发现:蛋白含量为61.29%,质谱鉴定出135种蛋白,18种氨基酸。给药10 d后,中高剂量组创面收缩明显,表皮厚度增加,新生胶原纤维增多;各给药组较模型组毛细血管网数有增加趋势;高剂量组较模型组血流量显著下降,血流趋于稳定。以上三种方法综合评估全层切除大鼠皮肤愈合过程中的药效学作用,提示中高剂量组具有显著促进血管生长及胶原纤维生长的作用,可以提高愈合质量。