二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)对HEK293T细胞自噬作用的影响。方法构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化。结果 1)测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调(P<0.05),突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4)Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调(P<0.05),但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异(P>0.05)。结论二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达。

二氢生物喋呤还原酶减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡的机制研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(QDPR)高表达对脂肪酸(PA)诱导的细胞凋亡的作用。方法 HEK293T细胞转染实验分为A、B、C 3组,A组为空载体转染组,B组为经过PA刺激的空载体转染组,C组为经过PA刺激的QDPR重组质粒转染组。首先将空载体及构建的QDPR重组质粒分别转染至HEK293T细胞,培养24 h后采用0.5 mmol/L PA刺激上述细胞,将没有经过PA刺激的空载体组细胞、PA刺激的空载体组细胞和PA刺激QDPR重组质粒组细胞三组细胞继续培养24 h后收集细胞。采用四氢生物喋呤(BH_4)和活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测3组BH_4和ROS的生成量;采用Western blot法检测3组凋亡相关蛋白Beclin1、Caspase 3和Beclin 2的表达。结果 (1)转染细胞后,QDPR融合蛋白成功表达;(2)与A组相比,B组的BH_4生成量差异无统计学意义;与B组相比,C组BH_4生成量明显增多(P<0.05);(3)与A组相比,B组的ROS生成量明显增加(P<0.05);与B组相比,C组ROS生成量明显下降(P<0.05);(4)Western blot结果显示:与A组相比,B组经过PA刺激后细胞中Beclin 1和Caspase 3表达水平显著上调(P<0.05),Beclin 2表达水平下降(P<0.05);QDPR过表达后C组Beclin 1和Caspase 3表达水平显著下调(P<0.05),Beclin 2表达水平升高(P<0.05)。结论 QDPR高表达后,可以刺激BH_4的生成,同时能降低PA诱导的ROS的生成量,还可以降低细胞凋亡相关蛋白Beclin 1和Caspase 3的表达,增强抗凋亡蛋白Beclin 2的表达,提示其可能通过调节BH_4和ROS含量影响细胞凋亡。

醌型二氢生物喋呤还原酶基因表达变化对高糖环境下NRK-52E细胞葡萄糖调节蛋白75表达的影响

目的探讨醌型二氢生物喋呤还原酶(QDPR)基因对高糖环境下肾小管上皮细胞系NRK-52E葡萄糖调节蛋白75(GRP75)的影响及其在DN中的可能作用机制。方法构建过表达及敲低QDPR基因的NRK-52E模型,分别予5.4 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖培养基培养,Western blot检测GRP75在OLETF大鼠肾皮质及细胞模型各组的表达水平,流式细胞术检测细胞周期。结果与LETO鼠比较,OLETF大鼠肾皮质GRP75含量降低[(1.53±0.27)vs(0.79±0.26),P<0.01];与NRK-52E组比较,NRK-52E高糖组的GRP75含量降低[(0.62±0.03)vs(0.46±0.06)]、G0/G1期细胞增多[(39.80±1.31)%vs(50.35±0.33)%]、S期细胞减少[(48.55±1.85)%vs(37.17±0.10)%](P<0.05);过表达QDPR使高糖环境下GRP75含量降低[(0.85±0.10)vs(0.45±0.16),P<0.05]、G0/G1期细胞增多[(43.73±0.48)%vs(61.87±0.17)%,P<0.01],S期细胞减少[(42.42±0.66)%vs(25.29±0.12)%,P<0.01];敲低QDPR不影响GRP75表达量与细胞周期。结论 GRP75在DN模型中含量减少,QDPR基因可能通过GRP75及细胞周期影响DN发生发展。

QDPR通过调控Beclin1改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化

目的探讨醌型二氢生物喋呤还原酶(QDPR)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型肾间质纤维化中的作用及对Beclin1的影响。方法通过单侧输尿管结扎的方法构建UUO模型,Masson、COLⅠ染色和Western blot技术分析纤维化进展及QDPR和Beclin1的表达情况。慢病毒输尿管逆行注射构建过表达QDPR基因和空载对照UUO模型,评估慢病毒感染效率和QDPR表达情况,并检测QDPR过表达对纤维化进展和Beclin1表达的影响。结果UUO模型组较假手术组的胶原纤维表达水平增高(P<0.05),QDPR表达水平降低(P<0.05),Beclin1表达增高(P<0.05)。通过输尿管逆行注射慢病毒,成功感染肾脏,并能增加肾脏QDPR表达。过表达QDPR后,胶原纤维表达水平降低(P<0.05),且Beclin1表达水平下降(P<0.05)。结论过表达QDPR抑制了Beclin1的表达水平,改善了纤维化的进展,提示过表达QDPR可能通过抑制Beclin1进而抑制肾间质纤维化。

QDPR基因表达水平对肾小管上皮细胞系NRK-52E细胞DHFR表达的影响

目的 OLETF大鼠醌式二氢生物喋呤还原酶(Quinoid dihydropteridine reductase,QDPR)存在K93T点突变,QDPR催化醌型二氢生物喋呤还原成四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4);二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)能将二氢喋呤还原成BH4,提示生物喋呤代谢与叶酸代谢通路之间有串扰。文中通过研究QDPR基因表达水平对肾小管上皮NRK-52E细胞DHFR表达的影响,探讨QDPR基因在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)中的作用机制。方法 Western blot检测高糖环境下NRK-52E细胞及OLETF大鼠DHFR蛋白表达情况。利用慢病毒技术感染NRK-52E细胞,制作空载过表达、过表达QDPR敲低随机序列对照和敲低QDPR模型。每组再分别给予5.4 mmol/L正常糖培养基和30 mmol/L高糖培养基培养细胞72 h,模拟DN模型。实验分组:NRK-52E对照组、NRK-52E高糖组、空载过表达病毒对照组、空载过表达病毒高糖组、QDPR基因过表达组、QDPR基因过表达高糖组、敲低随机序列对照组、敲低随机序列高糖组、QDPR基因敲低组、QDPR基因敲低高糖组。观察高糖环境QDPR基因的表达情况对DHFR蛋白表达水平的影响。结果 NRK-52E高糖组DHFR蛋白含量(0.33±0.16)低于NRK-52E对照组(0.64±0.05),差异有统计学意义(P<0.05);OLETF大鼠DHFR蛋白的表达水平(1.03±0.12)明显低于LETO大鼠的表达水平(1.56±0.16),差异有统计学意义(P<0.01)。与空载过表达病毒高糖组(0.63±0.08)相比,QDPR基因过表达高糖组DHFR蛋白含量(0.12±0.09)降低,差异有统计学意义(P<0.01);与敲低随机序列对照组(0.52±0.08)相比,QDPR基因敲低高糖组DHFR表达量(0.62±0.27)差异无统计学意义(P>0.05)。结论DHFR蛋白在DN的发生发展中可能起到重要作用,QDPR基因过表达使DHFR蛋白表达含量下降,QDPR基因过表达通过下调DHFR蛋白的表达水平进而影响DN的发展。

QDPR基因表达变化对高糖环境下NRK-52 E细胞氧化应激的影响

目的探讨醌型二氢生物喋呤还原酶（ quinoid dihydropteridine reductase, QDPR）表达变化对高糖环境下肾小管上皮细胞系 NRK-52E氧化应激的影响。方法利用慢病毒技术构建过表达及敲低QDPR基因的NRK-52E模型及其对照组,分别给予5.4 mmol/L及30 mmol/L葡萄糖培养基模拟正常及高糖环境,用流式细胞术dihydroethidium法检测各组细胞超氧阴离子（ O-2）含量。 Western印迹法检测超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）在各组表达水平。结果高糖环境下,过表达QDPR基因组与空载对照组相比细胞O-2含量降低（P〈0.01）,SOD1表达下调（P〈0.01）。低表达QDPR基因组与随机序列对照组相比O-2含量升高（P〈0.05）,SOD1表达无明显变化。结论高糖环境下,QDPR基因高表达能降低NRK-52E细胞氧化应激,沉默QDPR基因能增加NRK-52E细胞氧化应激。 QDPR基因可能通过影响氧化应激而影响糖尿病肾病的发生发展。

QDPR基因表达变化对高糖环境下NRK-52E细胞α-actinin表达的影响

目的探讨醌型二氢生物喋呤还原酶(Quinoid dihydropteridine reductase,QDPR)基因改变对高糖环境下肾小管上皮细胞系NRK-52Eα-辅肌动蛋白(α-actinin)的影响及其在糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)中的可能作用机制。方法 Western-blot检测DN动物(OLETF大鼠)以及对照LETO大鼠肾皮质的α-actinin蛋白含量。构建过表达及敲低QDPR基因的NRK-52E及其对照模型,分别给予正常糖(5.4mmol/L)和高糖(30mmol/L)培养基培养72h,Western-blot检测α-actinin在细胞模型各组的表达水平。结果 OLETF大鼠肾皮质内α-actinin含量降低[(0.86±0.32)vs(0.31±0.22),P<0.01];NRK-52E高糖组的α-actinin含量降低[(0.80±0.13)vs(0.44±0.10),P<0.05];与空载过表达病毒对照组(0.66±0.04)比,空载过表达病毒对照高糖组(0.42±0.06)及QDPR基因过表达组(0.49±0.06)的α-actinin蛋白表达含量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与QDPR基因过表达组相比,QDPR基因过表达高糖组的α-actinin含量降低[(0.49±0.06)vs(0.21±0.02),P<0.05];与空载过表达病毒对照高糖组比,QDPR基因过表达高糖组的α-actinin含量降低[(0.42±0.06)vs(0.21±0.02),P<0.05];与敲低随机序列对照组比,敲低随机序列对照高糖组的α-actinin降低[(0.93±0.09)vs(0.69±0.08),P<0.05];敲低QDPR基因不影响α-actinin蛋白表达量。结论α-actinin在DN模型中含量减少,QDPR基因可能通过α-actinin影响DN的发生、发展。