二氢生物蝶呤还原酶基因启动子核心调控区域的定位及研究

目的:前期结果表明QDPR参与糖尿病肾病的发生发展。本研究对QDPR基因启动子核心调控区域定位,分析其转录调控功能。方法:构建含有大鼠QDPR基因翻译起始位点上游2 092 bp序列的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。生物信息学预测潜在的核心启动子区域,并构建该区域多个片段缺失的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。分别瞬时转染HEK293T细胞,通过双萤光素酶报告基因活性分析,定位QDPR基因启动子的核心调控序列。结果:与-2 092^-1序列相比,缺失QDPR基因上游-529^-116序列的萤光素酶活性只有原来的1%(P<0.01),而仅保留-529^-1序列的萤光素酶活性是原来的64%(P<0.05)。将QDPR基因上游-529^-116序列逐段缺失后发现,分别缺失-529^-429,-428^-250,-141^-116三段序列的萤光素酶活性都显著升高(P<0.01),而缺失-249^-142序列的萤光素酶活性则显著下降(P<0.05)。结论:大鼠QDPR基因的核心启动子可能位于翻译起始密码子上游-529^-116区域内,该区域内存在多个转录因子Sp1的结合位点,可能是QDPR基因潜在的正性调控区和负性调控区。

3种小麦作物二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的生物信息学分析

为了研究彩色小麦色素合成中相关酶的性质及其基因,对已在NCBI上注册的普通小麦、蓝粒小麦、天蓝偃麦草的二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)核酸和氨基酸序列进行分析。通过生物信息学软件研究3种作物二氢黄酮醇4-还原酶的酶学特性,对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质二级结构和结构域进行预测和推断。结果表明,3种作物二氢黄酮醇4-还原酶基因长度均约为1.0 kb,编码354个氨基酸,三者氨基酸同源性很高。在蛋白质的其他预测中,发现三者均为酸性稳定亲水性蛋白,没有信号肽和跨膜结构域。二级结构以α-螺旋和自由卷曲为主,在进化树中可以看出蓝粒小麦与普通小麦亲缘关系较近。通过分析发现,小麦类作物二氢黄酮醇4-还原酶有着相同的特性,进化比较保守。为进一步研究其他特殊的小麦类作物相关酶及其基因提供理论依据。

芥菜型油菜4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析

利用同源克隆方法,在芥菜型油菜中克隆了DFR基因。在DNA和cDNA中扩增的DFR基因大小分别为1612bp和1214bp。该基因含有5个内含子,开放阅读框为1158bp,预计编码385个氨基酸,预测分子量为42886.0Da,推测的等电点为5.54。DFR基因在芥菜型油菜紫叶芥和黑籽近等基因系的叶片、胚和种皮中都表达,在四川黄籽中只在叶片和胚中表达。DFR基因在四川黄籽种皮中不表达,导致种皮中花色素和原花色素不能合成,从而种皮透明,形成黄籽,因此DFR基因是油菜种皮颜色形成途径中一个关键基因。本研究为利用该基因与种子、种皮特异启动子构建反义表达载体或RNAi载体,阐明油菜种皮颜色形成的分子机理和创造黄籽油菜新种质奠定了基础。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病化疗中甲氨蝶呤毒性相关性的meta分析

目的评价亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C 677 T位点多态性与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗用药甲氨蝶呤(MTX)不良反应易感性的关联。方法计算机检索The Cochrane Library、Pub Med、EMbase、EMCC、OVID、CNKI、VIP和Wan Fang Data数据库,检索时间均为建库至2016年3月。2名研究者独立筛选文献、提取资料数据并评价纳入研究的偏倚风险后,采用Rev Man 5.3和Stata 12.0软件,分别以隐性、显性、共显性、加性和等位基因模型对基因多态性与MTX化疗时不良反应的关联进行meta分析。结果共纳入12项研究,均为病例-对照研究,其中病例组1 419例,对照组2 188例。Meta分析结果显示,纳入的研究中MTHFR基因多态性在5种分析模型下与ALL患儿予以MTX化疗时中性粒细胞减少、血小板减少、血红蛋白减少、黏膜损害以及肝功能损害的不良反应均无关联。共显性模型下,MTHFR基因多态位点C677T与MTX总不良反应易感性的关联具有统计学意义(OR=1.39,95%CI:1.02~1.91,P=0.04)。隐性基因模型下,MTHFR的C677T多态性和MTX化疗时胃肠道不良反应的发生风险减少有关(OR=3.31,95%CI:1.03~10.59,P=0.04)。显性基因模型下,MTHFR的C 677 T多态性和MTX化疗时皮肤损害不良反应的风险减少存在关联(OR=3.05,95%CI:1.25~7.41,P=0.01)。结论 MTHFR的C 677 T多态性和MTX化疗时不良反应并无显著关联,但仍需行更大样本研究分析。

紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因(MsDFR)的克隆与分析

二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)是缩合单宁生物合成途径中的关键酶,在单宁的合成中起着重要的作用。根据同源克隆的原理,利用RACE技术,从"中苜一号"苜蓿中克隆得到DFR基因(MsDFR),并对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明,MsDFR基因cDNA全长1 402bp,包括开放阅读框1 023bp,编码340个氨基酸,在N端存在1个NADP结合位点"VTGASGFIGSWLVMRLMERGY",中部存在1个底物特异性结合的氨基酸基序"TLNVTEDQKPLWDESCWSDVEFCRRV"。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在荚果中表达量较高,根中较弱;在NaCl和GA3诱导下,MsDFR基因表达受到抑制;在黑暗条件下,该基因被诱导表达。由此推测"中苜一号"苜蓿中可能存在不依赖于GA3信号的单宁合成途径。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对儿童甲氨蝶呤化疗后毒副反应的影响

目的:研究亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因677C/T和1298A/C的2个SNPs分布对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿接受大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)化疗后毒副反应发生情况的影响。方法:收集43例ALL患儿外周血,提取基因组DNA,用PCR片段直接测序的方法检测MTHFR基因型,观察HD-MTX对患儿产生的毒副反应并评级。结果:MTHFR677CC基因型患儿在粘膜损害、感染、肝损害发生中等以上严重程度的比例高于677CT和677TT型(P<0.05),在胃肠道反应和外周血白细胞减少方面也高于677CT和677TT型,但差异无统计学意义(P>0.05)。MTHFR 1298AC基因型患儿发生中等以上严重程度粘膜损伤的比例高于1298AA基因型(P<0.05),其他方面比较差异均无统计学意义。结论:推测MTHFR基因多态性分布与ALL患儿HD-MTX化疗后发生毒副反应的严重程度有关,携带MTHFR 677CC基因型患儿可能更易发生较严重的毒副反应,临床上可结合疗效考虑用药剂量或做好解救和应对严重毒副反应的措施。

植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶,在花色的修饰中起重要作用。我们简述了DFR基因及其调节基因的研究进展,构建的系统进化树体现了部分单子叶与双子叶植物间的亲缘关系与进化差异,阐述了DFR调控基因的调控机制及DFR基因的应用前景。

杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响

为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。

急性淋巴细胞白血病患儿亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与甲氨蝶呤动态血药浓度相关性的研究

目的本研究旨在探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T、A1298C基因多态性对急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿使用大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)化疗期间的MTX动态血药浓度的相关关系。方法 35例ALL患儿外周血,提取基因DNA,应用PCR-RFLP方法检测MTHFR C677T、A1298C基因型;应用荧光偏振免疫分析法(FPIA)24h、48h、72h监测患儿外周血中甲氨蝶呤动态血药浓度。结果 MTHFR C677T各基因型间24 h MTX浓度有差异(P<0.05),携带CT型者明显高于携带CC型和TT型者;MTHFR C677T各基因型48 h、72 h的MTX浓度未见差异。MTHFR A1298C各基因型24 h、48 h7、2 h的MTX浓度未见差异(P>0.05)。结论 MTHFR C677T基因多态性影响ALL患儿HD-MTX化疗期间MTX血药浓度,提示在HD-MTX治疗时可根据检测MTHFR C677T基因型进行个体化治疗。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对甲氨蝶呤不良反应的影响

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性对类风湿关节炎治疗影响。方法收集类风湿关节炎(RA)病人210例,随机分为甲氨蝶呤(MTX)组,MTX+柳氮磺吡啶(SASP)组,MTX+来氟米特(LEF),SASP+LEF组。于治疗前及治疗后4,12,24及48周检查临床及实验室指标,评价治疗疗效,收集不良反应。同时测定病人的MTHFR基因C677T多态性。结果每组中3种不同基因型的病人之间的疗效差异无统计学意义。但前3组不良反应发生率TT和CT基因型组明显高于CC基因型组;CC基因型组病人随着病情好转,血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平逐渐下降,至48周,与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);而TT和CT基因型组病人随着病情好转,血浆Hcy水平下降不明显,均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。而SASP+LEF组中3组不同基因型病人之间不良反应发生率、血浆Hcy下降水平,差异无统计学意义(P>0.05)。结论MTHFR基因C677T多态性与类风湿性关节炎病人使用MTX出现的不良反应相关,可能与Hcy相关。

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达。分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸。序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75%～80%。系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近。半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到。原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达。从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成。

新疆维吾尔族和汉族急性淋巴细胞白血病患儿亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分布及甲氨蝶呤个体化用药分析

目的分析亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、A1298C位点基因型和等位基因在新疆维吾尔族和汉族急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿中的分布情况;通过基因检测指导甲氨蝶呤个体化用药方案,降低甲氨蝶呤不良反应的发生率。方法采用荧光染色原位杂交方法,检测2016年1月至2017年9月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院的35例维吾尔族和29例汉族ALL患儿的MTHFR C677T、A1298C基因多态性,分析两民族间基因型频率和等位基因频率是否存在差异;通过MTHFR C677T、A1298C基因型检测,调整1例发生甲氨蝶呤不良反应患儿的给药剂量。结果维吾尔族ALL患儿中,MTHFR C677T的3种基因型CC、CT和TT的分布频率分别为37.1%(13/35)、48.6%(17/35)和14.3%(5/35),等位基因C、T的分布频率分别为61.4%(43/70)、38.6%(27/70);汉族ALL患儿中,3种基因型CC、CT和TT的分布频率分别为58.6%(17/29)、20.7%(6/29)和20.7%(6/29),等位基因C、T的分布频率分别为69.0%(40/58)和31.0%(18/58)。维吾尔族ALL患儿中,MTHFR A1298C的3种基因型AA、AC和CC的分布频率分别为60.0%(21/35)、34.3%(12/35)和5.7%(2/35),等位基因A、C的分布频率分别为77.1%(54/70)、22.9%(16/70);汉族ALL患儿中,3种基因型AA、AC和CC的分布频率分别为55.2%(16/29)、44.8%(13/29)和0.0%(0/29),等位基因A、C的分布频率分别为77.6%(45/58)和22.4%(13/58)。维吾尔族和汉族ALL患儿MTHFR C677T、A1298C基因型频率和等位基因频率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。发生甲氨蝶呤不良反应的1例ALL患儿的MTHFR C677T基因型为CT,A1298C基因型为AC,经过基因型指导患儿甲氨蝶呤用药后,患儿不良反应症状较前有明显改善。结论新疆维吾尔族和汉族ALL患儿MTHFR C677T、A1298C基因型及等位基因分布频率不存在显著差异,但个体间MTHFR基因多态性差异可以作为降低甲氨蝶呤严重不良反应的重要参考因素之一,化疗方案开始前对患儿进行MTHFR基因检测是必要且可行的。

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因SrDFR,该片段长246bp,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰SrDFR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量PCR分析表明,SrDFR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。

二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)对HEK293T细胞自噬作用的影响。方法构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化。结果 1)测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调(P<0.05),突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4)Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调(P<0.05),但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异(P>0.05)。结论二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达。

二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究

以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中.

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因克隆及植物表达载体构建

采用RT-PCR方法,从蒺藜苜蓿(Medicargotrunctula)中克隆了二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段,并进行DFR基因植物表达载体的构建.结果表明:扩增的DFR基因片段全长约1 000 bp,编码337个氨基酸,与Gen-Bank中已注册的DFR基因核苷酸序列的同源性为99.80%.以pBI121为基础载体,构建了CaMV35S启动子驱动的DFR基因的植物表达载体pBIDFR,然后导入农杆菌EHA105,经PCR验证确定构建出植物表达载体.

银屑病亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与甲氨蝶呤疗效及不良反应的关系

目的:探讨银屑病患者亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677C/T多态性及其与长期小剂量甲氨蝶呤(MTX)方案治疗的疗效和不良反应的相关性。方法:运用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)的方法检测120例寻常型银屑病患者及100名健康对照组的MTHFRC677C/T多态性,比较两组间基因型及等位基因频率分布。在MTX治疗用药前,治疗后1、2、4、12周定期检查实验室指标,评价疗效及不良反应。结果:银屑病组MTHFR基因CC、CT、TT基因型分布分别为54.17%、32.50%、13.33%,与健康对照组(分别为43.00%、45.00%、12.00%)比较,差异无统计学意义(2=3.70,P>0.05)。有105例银屑病患者纳入疗效评估,各基因型间的疗效比较差异无统计学意义(2=1.45,P>0.05)。35.00%(42/120)患者出现不良反应,将有、无不良反应的两组基因型进行比较,差异有统计学意义(2=17.26,P<0.05),CT+TT基因型占不良反应组的71.43%,与无不良反应组(32.05%)比较差异有统计学意义(2=17.05,P<0.05)。29.17%(35/120)出现肝毒反应,将肝毒性组和无不良反应两组基因型分布比较差异有统计学意义(2=10.02,P<0.05),肝毒性组T等位基因出现频率较无不良反应组高,差异有统计学意义(2=7.52,P<0.05)。结论:MTHFR基因C677C/T多态性与银屑病的发病和MTX疗效无关,但与MTX治疗后的不良反应和肝毒性有关,T突变基因是不良反应的高危因素。

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因在烟草中的过量表达

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素合成途径中的关键酶,它在花色的修饰中起着很重要的作用,在烟草植物体内过量表达积累后,可能会使烟草的花色加深或变为红色。研究结果表明,通过转基因技术将NtDfr1,NtDfr2基因转入烟草后,获得转基因植株烟草的花色为红色,这与试验预期结果一致。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与甲氨蝶呤血药浓度、不良反应的相关性研究

甲氨蝶呤(MTX)剂量一血药浓度关系的个体差异大,临床用药过程中发现相同剂量的MTX用在不同的患者身上时其不良反应不一。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与MTX不良反应的相关性目前尚未有统一的研究结论。这可能与不同研究纳入的患者病种、用药剂量和合并用药有关。

二氢生物喋呤还原酶减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡的机制研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(QDPR)高表达对脂肪酸(PA)诱导的细胞凋亡的作用。方法 HEK293T细胞转染实验分为A、B、C 3组,A组为空载体转染组,B组为经过PA刺激的空载体转染组,C组为经过PA刺激的QDPR重组质粒转染组。首先将空载体及构建的QDPR重组质粒分别转染至HEK293T细胞,培养24 h后采用0.5 mmol/L PA刺激上述细胞,将没有经过PA刺激的空载体组细胞、PA刺激的空载体组细胞和PA刺激QDPR重组质粒组细胞三组细胞继续培养24 h后收集细胞。采用四氢生物喋呤(BH_4)和活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测3组BH_4和ROS的生成量;采用Western blot法检测3组凋亡相关蛋白Beclin1、Caspase 3和Beclin 2的表达。结果 (1)转染细胞后,QDPR融合蛋白成功表达;(2)与A组相比,B组的BH_4生成量差异无统计学意义;与B组相比,C组BH_4生成量明显增多(P<0.05);(3)与A组相比,B组的ROS生成量明显增加(P<0.05);与B组相比,C组ROS生成量明显下降(P<0.05);(4)Western blot结果显示:与A组相比,B组经过PA刺激后细胞中Beclin 1和Caspase 3表达水平显著上调(P<0.05),Beclin 2表达水平下降(P<0.05);QDPR过表达后C组Beclin 1和Caspase 3表达水平显著下调(P<0.05),Beclin 2表达水平升高(P<0.05)。结论 QDPR高表达后,可以刺激BH_4的生成,同时能降低PA诱导的ROS的生成量,还可以降低细胞凋亡相关蛋白Beclin 1和Caspase 3的表达,增强抗凋亡蛋白Beclin 2的表达,提示其可能通过调节BH_4和ROS含量影响细胞凋亡。