α-硫辛酸和二氢硫辛酸的抗氧化作用

采用多种化学发光体系和比色体系研究了氧化型硫辛酸——α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)和还原型硫辛酸——二氢硫辛酸(dihydrolipoic acid,DHLA)直接清除活性氧、抗脂质过氧化以及对.OH引起的DNA氧化损伤的保护作用.实验发现,LA和DHLA能有效清除相应体系中的活性氧过氧化氢(H2O2)、羟自由基(.OH)、过氧亚硝基阴离子(ONOO-)和二苯代苦味肼基自由基(DPPH.),能显著抑制脂质过氧化,并对.OH引起的DNA氧化损伤有良好的保护作用,而DHLA还可以有效清除超氧阴离子自由基(■).这些结果提示,LA和DHLA都是良好的抗氧化剂,但相比之下DHLA的抗氧化能力要显著强于LA.本研究为LA和DHLA保健和药用价值的进一步开发,提供了自由基生物学方面的依据.

大肠杆菌二氢硫辛酸转乙酰基酶的外周亚基结合结构域的溶液构象

丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸氧化脱羧,生成乙酰辅酶A.该复合体由丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)三种酶组成.大肠杆菌E2的外周亚基结合结构域(peripheral subunit-binding domain,PSBD)结合E1和E3,对丙酮酸脱氢酶复合物的结构和功能有重要作用.本研究采用PCR技术扩增了E2的PSBD的48个氨基酸残基区域编码序列(c DNA),构建p ET-32a-pp-Psbd表达载体,测序正确后转入BL21(DE3)中表达,目的蛋白质用镍柱和Hi Trap SP柱纯化后达到电泳纯,质谱鉴定纯化后蛋白质分子量与理论值符合.pull-down结果表明,PSBD可分别与E1和E3结合.圆二色谱表征PSBD的二级结构主要为a-螺旋,当在0.5mol/L Na Cl的离子强度下,55.7%的PSBD分子折叠为正确的构象.动态光散射实验发现,PSBD分子有3种不同的构象存在形式,因此,PSBD非常容易从折叠态转化为不和E1、E3结合的无规卷曲态,这种构象的相互转化为其功能性与E1、E3结合及解离提供了结构基础.

二氢硫辛酸琥珀酰转移酶在小鼠肾间质纤维化中的作用

目的:探讨二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)在小鼠肾间质纤维化中的作用。方法:采用结扎小鼠单侧输尿管建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型和HK2细胞缺氧模型,60只C57b/l小鼠随机分为假手术组(Sham,n=15)和UUO模型组(n=45),UUO模型组又随机分为1周(n=15)、2周(n=15)和3周组(n=15);HK2细胞实验分为对照组、缺氧组、缺氧加DLST高表达组和DLST干扰组。HE和Masson染色观察各组小鼠肾脏病理性变化,免疫组化观察在体实验不同时间点DLST的表达,Western-blot检测DLST、I型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和α-SMA的蛋白变化,细胞实验中采用质粒高表达和shRNA干扰DLST。结果:HE和Masson染色显示,与Sham组相比,UUO模型小鼠均出现肾小管损伤,肾小管上皮细胞变性,肾间质有大量炎性细胞浸润,损伤程度逐渐加重。Western Blot结果表明,与Sham组相比,UUO模型小鼠肾脏Col-Ⅰ和α-SMA的表达显著增加(P<0.05),而DLST的表达明显减少(P<0.05),均呈现时间依赖性。免疫组化结果表明,与Sham组相比,UUO组DLST的表达逐渐减少。细胞实验结果显示,正常条件下干扰DLST后,纤维化蛋白Col-Ⅰ表达明显增加(P<0.01),而缺氧条件下,高表达DLST后可明显减少Col-Ⅰ蛋白的表达(P<0.01)。结论:小鼠肾脏DLST蛋白表达的减少是导致肾间质纤维化的重要原因,可能通过引起能量代谢障碍参与肾间质纤维化的发生过程。

硫辛酸抗氧化性及其生理保健功能研究进展

硫辛酸抗氧化性近年来日益受到人们的关注。硫辛酸是一种万能抗氧化剂,它及它的还原型式二氢硫辛酸都具有很强的抗氧化性,它们可以通过清除多数自由基、螯合金属离子、再生体内其它抗氧化剂来发挥抗氧化作用。硫辛酸可以治疗与防御许多与氧化应激有关的疾病,如糖尿病、老年痴呆、衰老、心血管疾病等,在医药、保健食品、化妆品等领域显示出广泛的应用前景。本文对其抗氧化性及其生理保健功能进行了概述。

α-硫辛酸的生物医学功能

α 硫辛酸及其还原态二氢硫辛酸是高效抗氧剂 ,可以清除自由基和活性氧 ,螯合金属离子 ,再生谷胱甘肽、维生素C、维生素E、硫氧还蛋白等抗氧剂 ,可改善葡萄糖代谢 ,减弱氧化应激 ,对糖尿病性白内障、糖尿病多发性神经病及心血管损伤等糖尿病并发症具有较好的预防和治疗作用。

α-硫辛酸与核因子-КB信号通路

α-硫辛酸是一个在少数细胞内合成的二硫化合物,它的天然功能是作为丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合体中的辅酶。药理剂量下,α-硫辛酸是一个多功能的抗氧化剂,具有一般抗氧化剂所不能及的抗氧化性．它可以对与氧化应激有关的多种疾病如心脏病、糖尿病、高血压、局部缺血一再灌注、退行性病变等具有预防和治疗作用.

α-硫辛酸对急性冠脉综合征患者心肌损伤保护作用的研究

目的 探讨α-硫辛酸（α-LA）对急性冠脉综合征（ACS）患者心肌损伤的保护作用。方法 研究对象为59例急性冠脉综合征患者,随机分为常规药物治疗组和α-LA组。常规药物组29例给予抗栓、调脂、扩管药物治疗;α-LA组30例在常规药物治疗基础上加用α-LA（600mg/d,IVD,疗程3d）。2组在用药前0h、用药后24h和72h各采取静脉血4~5ml,采用ELISA法测定血清乙醛脱氢酶2（ALDH2）活性,硫代苯巴比妥酸法测定血清丙二醛（MDA）水平,微量酶标法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）含量,LVEF通过心脏彩色多普勒超声心动图检查测定。结果 1两组在用药前0h的血清ALDH2活性、MDA及LDH水平、LVEF值无显著差异;2两组在用药24h和72h后血清ALDH2活性水平较用药前0h明显上升（P〈0.01）,MDA较用药前0h显著下降（P〈0.01）;LDH水平在用药72h较24h显著下降（P〈0.01）,LVEF值72h和1周后均有明显升高（P〈0.05）;3与常规治疗组比较,α-LA组在用药24h及72h后血清ALDH2活性均显著上升（P〈0.01）,MDA水平显著下降（P〈0.05）,LDH亦显著下降（P〈0.01）,LVEF值1周后升高更显著（P〈0.05）。结论 α-LA上调ACS患者的ALDH2活性,减少过氧化终产物MDA的生成,减轻心肌组织缺血及缺血再灌注后的氧化损伤（LDH水平回降）。

铜绿假单胞菌二氢硫辛酸酰胺脱氢酶的重组表达及其与脂蛋白(a)的相互作用

【目的】二氢硫辛酸酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,Lpd)是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)表面的一种纤溶酶原(Plasminogen,Plg)受体,旨在研究Lpd与脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]以及Plg之间的相互作用。【方法】用大肠杆菌表达rLpd及其突变分子(rLpd K476A、rLpd K477A、rLpdΔKKR),用酶联免疫吸附实验(ELISA)、亲和色谱层析及Western blot等技术检测rLpd及其突变分子与Lp(a)、Plg的相互作用。【结果】ELISA及亲和色谱层析实验结果表明,rLpd可以与Lp(a)结合但不与LDL结合,Lp(a)与rLpdΔKKR的结合能力显著低于其与rLpd的结合能力。1 mmol/L的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)对rLpd与Lp(a)的结合有显著的抑制作用。1 000μg/L的Lp(a)对rLpd与Plg的结合起到显著的抑制作用。【结论】Lpd能够与Lp(a)特异性结合,其476和477两个相邻的赖氨酸残基是与Lp(a)结合的主要位点,Lp(a)可以竞争性地抑制rLpd与Plg的结合。

牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物酶比活性的测定

参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化表达产物His-DLD,并对其酶促反应活性进行测定。结果显示,表达产物在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,且其最适酶促反应温度为25℃、pH为7.5;其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率为25.6μmol/(L·min)。上述结果为研究二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能奠定了基础。

二氢硫辛酸抗氧化性机理的理论研究

分别在B3LYP/6-31G(d,p)和B3LYP/6-311++G(d,p)水平下,对二氢硫辛酸及可能的解离途径中形成的自由基进行结构优化,采用S—H键解离焓(EBD)和分子的电离势(EIP)为理论指标,探讨了二氢硫辛酸可能的抗氧化性机理,并研究了溶剂(水和苯)效应的影响.结果表明,C(1)上S—H断裂形成的自由基b较易形成;以EBD和EIP为理论指标,可以较好的说明分子的抗氧化性及溶剂效应对抗氧化性的影响.随着溶剂的极性增加,EBD变化较小,而EIP则显著减小,表明溶剂效应对清除自由基的电子转移反应机理影响更大.分子最高占据轨道HOMO能级顺序与EIP数值所预测的抗氧化性顺序一致.

乳酸发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)氟丙酮酸敏感突变型赖氨酸的生产

从乳酸发酵短杆菌AJ3990诱发产生的FP—敏感突变型中可以选得较高赖氨酸产量的菌株。洗涤细胞在FP及生物素共存时,可以协同刺激赖氨酸的生成。FP分别在0.04mM和1 mM浓度时,可以抑制AJ3990 50%细胞生长及PDH的活力。因此,FP及过量的生物素对于赖氨酸的生物合成的协同效应似乎是由于PDH/PC活力比例的最优化造成的。这可以通过选择FP—敏感突变型,并从中得到具有赖氨酸合成最佳的PDH活力菌种而证实。赖氨酸生产菌产量最高菌种,AJ11204,经比较,仅为亲本AJ3990PDH活力的27%。它在过量生物素存在时,产生70克/升赖氨酸及从葡萄糖50%转化率。

靶向铜死亡相关基因治疗类风湿关节炎生物信息学分析及干预中药的预测

目的探索铜死亡相关基因在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)中的表达及其作用机制,并筛选通过靶向铜死亡基因治疗RA的潜在中药。方法通过检索GEO数据库获得RA芯片数据,分析铜死亡基因在RA中表达水平;依据铜死亡基因表达情况构建高表达亚型和低表达亚型,并进行差异分析,筛选出与RA相关的铜死亡基因。按不同分组对基因表达矩阵进行免疫浸润分析,并分析免疫浸润细胞与铜死亡基因之间的相关性。利用Kobas在线工具对差异基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。通过Herb数据库检索靶向铜死亡基因治疗RA的潜在中药及其有效成分,使用Autodock vina软件模拟药物与铜死亡靶蛋白结合活性。通过收集临床样本验证铜死亡相关基因在RA中表达水平。结果FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1和PDHB 7个铜死亡相关基因在RA中差异表达。免疫浸润分析结果显示,在RA中活化的记忆CD4+T细胞、静息自然杀伤(natural killer,NK)细胞和中性粒细胞与铜死亡相关。富集分析结果显示,铜死亡主要与趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子-κB信号通路、p53信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路相关。虎杖叶可能是靶向铜死亡基因治疗RA的潜在中药。分子对接结果显示,虎杖叶有效成分均有与铜死亡靶蛋白结合的可能。DLD、GLS、FDX1、DLAT在RA患者外周血单个核细胞中m RNA表达水平升高。结论铜死亡相关基因表达水平与RA病程进展相关,并预测虎杖叶是潜在靶向铜死亡基因治疗RA的药物,为RA的临床诊疗及药物开发提供了新的方向和理论基础。

银纳米簇荧光探针检测L-半胱氨酸

常温下合成了二氢硫辛酸(DHLA)包裹的银纳米簇(AgNCs),并基于L-半胱氨酸对AgNCs的荧光猝灭现象构建了AgNCs荧光探针对Cys的检测方法。结果表明,在优化条件下,AgNCs的荧光猝灭程度和Cys浓度在2.0~100μmol/L范围内呈现良好的线性关系(R2=0.998),检出限为1.77μmol/L(S/N=3)。在人体血清样品中Cys检测的加标回收率为94.0%~102.4%。

基于化学成分差异的不同干燥方式熊胆粉镇痛作用研究

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结合的手段研究熊胆粉的化学成分差异;借助PharmMapper、Uniprot、GeneCards数据库及文献,获取熊胆粉成分和病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的作用靶点,并采用动物试验对其药效进行验证;对疾病靶标-药物靶标集做拓扑分析获得核心靶标,并进行基因本体(GO)功能和基因与信号通路分析(KEGG)通路富集,通过Cytoscape3.8.2软件构建成分-靶标-通路网络图。结果常压干燥、减压干燥熊胆粉共有成分721个,差异成分8个(L-焦谷氨酸、鸟苷5′-单磷酸水合物、5,6-二氢胸腺嘧啶、7-甲基黄嘌呤、左旋甲状腺素、甲基间酪氨酸、大黄素8-葡萄糖苷、益母草碱),搜索得到差异成分潜在靶点共1605个;检索得到病毒性肝炎靶点7444个、胆囊炎靶点636个、冠心病靶点7563个;熊胆粉对病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的共同靶点有282个,GO功能富集分析得到GO条目759个(P<0.05),其中生物过程(BP)条目717个,细胞组成(CC)条目21个,分子功能(MF)条目21个;熊胆粉中的鸟苷5′-单磷酸水合物、甲基间酪氨酸、左旋甲状腺素及大黄素8-葡萄糖苷等成分可能通过二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase,DLD)、过氧化氢酶(atalase,CATC)及一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)等靶点,调节代谢通路和癌症通路等信号通路发挥其镇痛作用。药效试验结果表明常压、减压干燥熊胆粉均对热板及醋酸所致小鼠疼痛有抑制作用,且减压组镇痛作用强于常压组,有显著性差异(P<0.05)。结论干燥方式使得熊胆粉化学成分变异,从而导致其镇痛作用差异,初步探索了熊胆粉镇痛作用的机制,建议大生产中采用减压干燥制备熊胆粉,为熊胆粉合理应用提供了一定依据。