二氢硫辛酸琥珀酰转移酶在小鼠肾间质纤维化中的作用

目的:探讨二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)在小鼠肾间质纤维化中的作用。方法:采用结扎小鼠单侧输尿管建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型和HK2细胞缺氧模型,60只C57b/l小鼠随机分为假手术组(Sham,n=15)和UUO模型组(n=45),UUO模型组又随机分为1周(n=15)、2周(n=15)和3周组(n=15);HK2细胞实验分为对照组、缺氧组、缺氧加DLST高表达组和DLST干扰组。HE和Masson染色观察各组小鼠肾脏病理性变化,免疫组化观察在体实验不同时间点DLST的表达,Western-blot检测DLST、I型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和α-SMA的蛋白变化,细胞实验中采用质粒高表达和shRNA干扰DLST。结果:HE和Masson染色显示,与Sham组相比,UUO模型小鼠均出现肾小管损伤,肾小管上皮细胞变性,肾间质有大量炎性细胞浸润,损伤程度逐渐加重。Western Blot结果表明,与Sham组相比,UUO模型小鼠肾脏Col-Ⅰ和α-SMA的表达显著增加(P<0.05),而DLST的表达明显减少(P<0.05),均呈现时间依赖性。免疫组化结果表明,与Sham组相比,UUO组DLST的表达逐渐减少。细胞实验结果显示,正常条件下干扰DLST后,纤维化蛋白Col-Ⅰ表达明显增加(P<0.01),而缺氧条件下,高表达DLST后可明显减少Col-Ⅰ蛋白的表达(P<0.01)。结论:小鼠肾脏DLST蛋白表达的减少是导致肾间质纤维化的重要原因,可能通过引起能量代谢障碍参与肾间质纤维化的发生过程。

大肠杆菌二氢硫辛酸转乙酰基酶的外周亚基结合结构域的溶液构象

丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸氧化脱羧,生成乙酰辅酶A.该复合体由丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)三种酶组成.大肠杆菌E2的外周亚基结合结构域(peripheral subunit-binding domain,PSBD)结合E1和E3,对丙酮酸脱氢酶复合物的结构和功能有重要作用.本研究采用PCR技术扩增了E2的PSBD的48个氨基酸残基区域编码序列(c DNA),构建p ET-32a-pp-Psbd表达载体,测序正确后转入BL21(DE3)中表达,目的蛋白质用镍柱和Hi Trap SP柱纯化后达到电泳纯,质谱鉴定纯化后蛋白质分子量与理论值符合.pull-down结果表明,PSBD可分别与E1和E3结合.圆二色谱表征PSBD的二级结构主要为a-螺旋,当在0.5mol/L Na Cl的离子强度下,55.7%的PSBD分子折叠为正确的构象.动态光散射实验发现,PSBD分子有3种不同的构象存在形式,因此,PSBD非常容易从折叠态转化为不和E1、E3结合的无规卷曲态,这种构象的相互转化为其功能性与E1、E3结合及解离提供了结构基础.

二氢硫酰胺-S-琥珀酰转移酶在HER2阳性乳腺癌中的功能初探

目的:分析人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌患者中二氢硫酰胺-S-琥珀酰转移酶(DLST)的表达水平,评估其对患者生存预后的影响,同时探讨DLST在HER2阳性乳腺癌发生发展中的潜在机制。方法:(1)使用CancerSEA数据库进行筛选,分析乳腺癌中DLST表达的特异性,再通过Kaplan-Meier Plotter数据库研究DLST对不同分型乳腺癌患者预后的影响。(2)采用CancerSEA数据库探索和验证DLST相关的信号通路。通过免疫沉淀、GST-pull down实验确定在HER2阳性乳腺癌中与DLST相互作用的蛋白。(3)利用TIMER 2.0数据库对DLST与免疫细胞浸润的相关性进行分析。结果:DLST在乳腺癌患者中表达升高,DLST表达越高,HER2阳性乳腺癌患者的预后就会越差并且其生存期也会越短;DLST抑制HER2阳性乳腺癌细胞的凋亡;DLST在HER2阳性乳腺癌的M2巨噬细胞中升高。Neddylation修饰后的PTEN蛋白与DLST存在相互作用。结论:DLST在HER2阳性乳腺癌患者中高表达,与其恶性进程呈正相关,且不利于HER2阳性乳腺癌患者的总体生存预后,初步的机制研究认为DLST与Neddylation修饰后的PTEN蛋白具有相互作用。除此之外,DLST会抑制肿瘤细胞凋亡,并且促进M2型巨噬细胞的浸润。因此,DLST可能成为HER2阳性乳腺癌患者的一种潜在治疗靶标和预后指标。

南极深海底泥色盐杆菌属NJS-2 ectABC基因克隆及二氨基丁酸转氨酶ectA基因的表达

从南极深海底泥中分离筛选得到一株中性嗜盐菌Chromhalobacter sp.NJS-2,以该菌株基因组为模板,利用PCR技术扩增出ectABC基因,基因全序列大小为2378bp。OMIGA软件分析该基因序列上含有三个阅读框,大小分别为576bp、1272bp和393bp,预测其分别编码二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)、二氨基丁乙酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合酶(EctC)。将二氨基丁酸乙酰转移酶ectA基因的PCR扩增产物克隆至表达载体pET-his,构建重组表达载体pET-his-ectA,并经酶切、PCR鉴定和测序验证,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE分析,出现大小约21kDa的目的蛋白条带。

二氢脂酰胺琥珀酰转移酶基因型与Alzheimer病遗传易感性的关系

目的 探讨二氢脂酰胺琥珀酰转移酶 (DLST)基因 1 3号内含子A1 91 1 7G和 1 4号外显子C1 91 83T位点基因多态性与散发性Alhzeimer病 (SAD)遗传易感性的关系。方法 应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法检测了 1 0 5例SAD患者和 1 0 9名正常老年人的DLST基因多态性分布特征。结果 SAD组AC等位基因频率、AC/AC、AT/AT单倍体基因型频率低于对照组。SAD组分别为 1 3 %、3 %、1 0 % ,对照组分别为 1 7%、9%、1 7% ;SAD组GC等位基因频率、GC/GC单倍体基因型频率高于对照组。SAD组为 48%、3 0 % ,对照组为 43 %、2 4% ,但 2组差异无显著意义 (P >0 .0 5)。SAD组AT/AC单倍体基因型频率高于对照组 :SAD组为 2 1 % ,对照组为 1 0 % ,2组差异有显著意义 (P≤ 0 .0 5) ,相对危险性为 2 .3 6。结论 携带DLST基因AT/AC单倍体基因型的个体较非携带者患SAD的风险增高 2 .3 6倍。

基于代谢通量分析的琥珀酸放线杆菌高产选育研究

在对产琥珀酸放线杆菌代谢分析的基础上选育出高产突变株对琥珀酸的工业生物转化有重要意义。在矩阵分析代谢通量基础上,围绕柔性节点下的副产物乙酸及乙醇的降低分别实施软X诱变及定点突变选育,并对比分析了突变株与出发株相关酶活及基因序列变化。针对出发株的流量分析显示产物琥珀酸的代谢通量为1.78(mmol/g/h),主要副产物乙酸与乙醇的代谢通量分别为(0.60mmol/g/h)和(1.04mmol/g/h),并发现乙醇代谢加剧了琥珀酸合成中的H电子供体的不足;筛选出的氟乙酸抗性突变株S.JST1的乙酸代谢通量降低了96%,为0.024(mmol/g/h),酶活检测表明磷酸乙酰转移酶(Pta)的酶比活力从602降低到74,进一步的序列对比分析发现pta突变基因中产生了一个突变位点;adh定点复合突变株S.JST2的乙醇代谢通量降低了98%,为0.020(mmol/g/h),酶活检测表明Adh的酶比活力从585降低到62,最终突变株S.JST2琥珀酸累积产量达65.7g/L。围绕产琥珀酸放线杆菌Pta及Adh酶活的降低实施定向选育,在降低副产物流量的同时,有助于改善细胞H供体代谢平衡进而提高琥珀酸的流量。所获突变株具有工业应用潜力。

α-LA对大鼠股四头肌线粒体抗氧化能力与能量代谢标志酶活性的影响

选用SD雄性大鼠,分为安静对照组(QC组)、运动对照组(EC组)和运动加α-硫辛酸组(EPL组),每组8只。第6周最后1天取股四头肌,制备线粒体样品,分别测试大鼠股四头肌线粒体抗氧化指标、表征线粒体功能的标志酶活性,探讨线粒体营养素α-硫辛酸(ɑ-LA)对大鼠股四头肌线粒体抗氧化能力与能量代谢标志酶活性的影响。结果显示,EC组、EPL组抗氧化酶活性与QC组比较下降(P<0.01或P<0.05);与EC组比较,EPL组抗氧化酶活性上升(P<0.05或P<0.01)。与QC组比较,EC组、EPL组MDA和H2O2含量升高(P<0.01);与EC组比较,EPL组MDA和H_2O_2的含量下降(P<0.01)。与QC比较,EC组和EPL组三种ATPase活性下降(P<0.01或P<0.05);与EC组比较,EPL组三种ATPase活性上升(P<0.05或P<0.01)。与QC组比较,EC组功能标志酶活性下降(P<0.05或P<0.01),EPL组功能标志酶活性下降(P<0.05);与EC组比较,EPL组功能标志酶活性上升(P<0.05或P<0.01)。EPL组大鼠运动至疲劳的时间延长30.05%。结果表明,α-LA对运动训练大鼠体重增长无不良影响,对线粒体的结构与功能具有维护作用,可保证线粒体的氧化供能效率,提高大鼠的有氧运动水平,具有较强的抗疲劳功效。

铜死亡相关基因DLAT在胰腺癌中的表达及临床意义

目的 探讨铜死亡相关基因在胰腺癌中发挥的作用,构建预后模型,筛选并验证铜死亡相关基因在胰腺癌中发挥的重要作用。方法 利用生物学数据库分析胰腺癌中铜死亡相关基因的表达水平、预后分析并构建预后模型。结果 以二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT)为代表的铜死亡相关基因在胰腺癌中高表达(P均<0.05)。以铜死亡相关基因构建预后模型,与低风险评分胰腺癌患者相比,高风险评分胰腺癌患者预后较差(P<0.05)。公共数据库及临床数据的免疫组织化学法验证了DLAT在胰腺癌中高表达不利于胰腺癌患者预后,其表达水平可作为胰腺癌患者病情进展的独立危险因素(P均<0.05)。结论 铜死亡相关基因可以作为胰腺癌患者潜在的预后预测因子。以DLAT为代表的铜死亡相关基因可能为胰腺癌治疗提供新的途径。