基于AS-PCR技术pfdhps耐药位点快速检测平台的建立及评价

目的磺胺多辛-乙胺嘧啶(SP)是WHO推荐的非洲地区间歇性预防治疗孕妇及儿童疟疾的主要药物。SP耐药性(SPR)的出现及传播给疟疾防控带来严峻挑战。恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因(pfdhfr)和二氢蝶酸合酶基因(pfdhps)作为SP耐药分子标记被广泛用于SPR监测。本研究旨在建立一种快速、低成本的pfdhps检测平台,为疟疾精准防控提供新的分子检测方法。方法基于等位基因特异性PCR(AS-PCR)原理,针对每个单核苷酸多态性(SNPs)位点设计野生型及突变型引物,对引物的倒数第三个碱基增加人工错配及硫代修饰。以人工构建的pfdhps重组质粒为模板,筛选最佳PCR体系及反应条件,建立pfdhps快速检测平台,以琼脂糖凝胶显影的方式呈现基因型检测结果。以梯度稀释的质粒为扩增模板,评估检测方法的灵敏度和特异性。结果针对pfdhps的不同位点,表现出不同的检测灵敏度及特异性,其中突变率最高的437位点质粒DNA灵敏度达10^(3)拷贝/μL,无非特异性扩增;540位点检测灵敏度为10^(4)拷贝/μL,但在质粒浓度大于10^(8)拷贝/μL时出现非特异性扩增;581位点检测灵敏度为10^(6)拷贝/μL,特异性良好。结论基于AS-PCR技术、辅以人工碱基错配及硫代修饰建立的快速基因分型检测方法具有较高的检测灵敏度及特异性,该方法不仅限于抗疟药物耐药基因检测,还可扩展至其他传染病的快速诊断以及遗传性疾病、肿瘤的快速诊断。