东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。

紫杉二烯合成酶基因转化红豆杉内生真菌XT5的研究

[目的]研究紫杉二烯合成酶基因转化短叶红豆杉(Taxus brevifolia)内生真菌XT5的情况。[方法]采用土壤农杆菌介导法将来自红豆杉中的紫杉二烯合成酶基因转入红豆杉内生真菌XT5中,研究紫杉醇发酵产量。[结果]成功转化得到8株重组子,其中XT5-TS-2的紫杉醇含量得到了大幅提高,其最高产量为423.983 4μg/L,比原始菌株提高了53.19%,表明转化紫杉二烯合成酶基因能够有效提高紫杉醇产量。[结论]该研究可为提高红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇产量提供理论支持。

紫杉二烯合成酶

紫杉二烯合成酶是第一个被详细研究和目前所发现的最重要的紫杉醇合成代谢酶,它催化紫杉醇生物合成途径中的第一个定向的、慢速的步骤,然而该步骤并非限速步骤。文章综述了紫杉二烯合成酶的酶学特性、催化机理、cDNA克隆和表达,以及对紫杉醇合成代谢通量的影响等方面的研究进展,指出紫杉醇生物合成途径中的限速步骤位于距环化步骤较远的下游处。

南方红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA的克隆

目的采取分子手段通过紫杉醇生物合成途径对细胞中的紫杉醇产量进行调控。方法根据已发表的中国红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA序列设计2对引物,从南方红豆杉愈伤组织提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1 201 bp和3’端长度为1 388 bp的2个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,证实确为紫杉二烯合成酶基因。将这2个cDNA片段与双元载体pCAMBI-A1300连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。结果成功得到全长为2 589 bp的紫杉二烯合成酶基因,编码862个aa。结论南方红豆杉紫杉二烯合成酶基因与中国红豆杉紫杉二烯合成酶基因具有98%的同源性;并且紫杉二烯合成酶cDNA成功插入到pCAMBIA1300中,为下一步的转基因工作做好了准备。

白桦环阿齐醇合成酶(CAS)基因与达玛烯二醇合成酶(DS)基因的双基因RNA干扰载体构建

环阿齐醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)和达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol synthase,DS)为白桦三萜合成过程分支途径关键酶基因,对CAS和DS基因的抑制或沉默将有利于三萜前体-2,3氧化角鲨烯向目标产物白桦脂醇和齐墩果酸合成。利用同源序列PCR方法及pRNAi-GG新型载体,进行DS单基因RNAi及DS与CAS双基因RNAi载体的构建。结果显示,分别克隆获得CAS和DS c DNA序列长度为300和509 bp,Blast同源序列比对与已知日本白桦BPX1和OSCBPD相似度为100%和92%。依据基因RNAi引物设计及pRNAi-GG使用原则,分别将CAS、DS的正向片段和反向片段有序地连接到pRNAi-GG载体PDK内含子两侧,并转化大肠杆菌Trans1-T1中,经PCR及克隆测序验证,获得白桦DS单基因和CAS、DS双基因干扰载体,并通过三亲杂交方法分别获得含有两个RNAi载体的工程农杆菌菌株。该研究为进一步通过基因工程手段阻断白桦三萜分支途径及促进前体物质向目标产物白桦酯醇和齐墩果酸方向合成奠定了基础。

二甲烯丙基色氨酸合成酶的生物信息学分析

以二甲烯丙基色氨酸合成酶(DMATS)为研究对象,通过生物信息学方法共检索到37种微生物中的77条DMATS蛋白质序列。使用MEGA v4.0软件构建DMATS系统进化树发现,这些同源序列可分为两大簇,在第一簇中全为真菌的聚类,而第二簇中是细菌和真菌的聚类,初步分析可能是由于细菌和真菌的进化速度不同或DMATS基因是一个独立复制事件。在进行DMATS的信号肽结构预测时发现,只有Ajellomyces capsulata的DMATS(登录号:C6HC16)含有信号肽结构,由此可知,Ajellomyces capsulata(C6HC16)的DMATS可能是分泌蛋白质。通过使用MEME v4.9进行分析,最终得到了7条保守的motifs序列,这些motifs可能对DMATS发挥功能具有重要作用。

水稻丙二烯氧化物合成酶基因OsAOS1的表达研究

茉莉酸(Jasmonate,JA)为植物病虫害抗性反应中重要的信号分子,茉莉酸类物质生物合成途径中的关键酶为丙二烯氧化物合成酶(Allene oxide synthase,AOS)。已知水稻AOS基因家族包括4个成员,Os-AOS1～OsAOS4。已有研究表明,水稻OsAOS2基因的过量表达提高了内源PR1基因的表达、增强了水稻对稻瘟病的抗性。本研究分析了OsAOS1基因表达的组织和器官特异性以及外源JA处理对OsAOS1基因表达的影响,同时利用转基因技术研究了OsAOS1基因在调控内源PR1基因表达中的作用。研究结果表明:OsAOS1基因表达的组织和器官特异性不同于OsAOS2基因;外源JA处理诱导OsAOS1基因的瞬时表达,然而OsAOS2基因的诱导表达延迟;OsAOS1过量表达抑制烟草中内源PR1基因的表达。据此推测OsAOS1基因可能不参与依赖于PR1的抗病反应。

银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析

植物来源细胞色素P450的表达和结晶都十分困难,成为成功解析该类蛋白晶体结构的瓶颈。探索了使用大肠杆菌表达系统表达、纯化银胶菊丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)的方法。氨基酸序列比对分析显示,银胶菊AOS缺失N-末端的膜锚定序列和信号肽序列,推测其在大肠杆菌中应表达为水溶性蛋白质。试验中纯化得到的银胶菊AOS是一个分子量为54.5 kD的八聚体分子,均一性好,不含去垢剂,达到毫克量级,适合下一步的晶体培养研究;还原一氧化碳差示光谱显示该酶在450 nm处有特征吸收峰,酶活性测定得到该酶的米氏常数为45.3μmol/L,显示该重组AOS具有很高的酶活性。

紫杉醇生物合成酶的研究进展

抗癌药紫杉醇是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物.研究紫杉醇生物合成酶,特别是其合成关键酶,将为利用基因工程手段大量生产紫杉醇打下基础.对紫杉醇生物合成过程中参与酶的研究进展作一综述.

抑制齐墩果烷型人参皂苷合成支路对达玛烷型人参皂苷生产能力的影响

表达反义βAS的5个人参发根系在液体培养条件下生长30天后,齐墩果烷型人参皂苷R0含量比对照实验组均有所降低,幅度分别达13%～40%;达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1含量在5个发根系中均有所增加,其中发根系A19的上述单体皂苷含量总和比对照实验组提高了30%;培养过程中达玛烷型人参皂苷含量呈逐渐增加趋势。5个发根系的βAS酶活性比对照实验组均有所下降,最多下降30%,DAS酶活性被上调,尤其发根系A19的酶活性比对照实验组提高了20%;化学分析结果显示,5个发根系人参皂苷前体物2,3-氧化角鲨烯的含量比对照实验组均有所提高。

珠子参皂苷合成途径3个关键酶基因CAS、DS和β-AS时空表达分析

旨在明确环阿屯醇合成酶(CAS)、达玛烯二醇合成酶(DS)和β-香树酯合成酶(β-AS)基因在珠子参中的时空表达情况及其与总皂苷含量的关系。以珠子参叶、茎、花和根状茎为材料,采用实时荧光定量技术检测了3个酶基因在不同时期的表达情况,并分析了基因表达与总皂苷含量之间的关系。CAS、DS和β-AS均在珠子参地上部分高表达,在根状茎中低表达;5—9月间CAS在根状茎中的表达呈现出"高—低—高"的趋势,而DS和β-AS则表现出相反的趋势;珠子参总皂苷含量变化呈"S"型曲线,其前期含量与DS和β-AS的表达呈正相关关系。推测珠子参皂苷最初和主要的合成部位为叶,根状茎可能是后期部分皂苷合成的场所。

采用巢式PCR-直接测序法分析人参达玛烯二醇合成酶基因单核苷酸多态性

目的建立人参皂苷生物合成通路中的关键酶——人参达玛烯二醇合成酶(DS)基因c DNA序列的单核苷酸多态性(SNP)检测方法,为人参属植物DS基因的SNP研究以及人参类药材的品种鉴定提供参考。方法采集不同产地、不同品种和生长年限的人参样品,提取RNA,逆转录为c DNA。采用巢式PCR进行扩增,根据人参DS基因c DNA保守序列设计1组引物用于第1轮PCR,2组DS基因上下游分段引物用于第2轮PCR,扩增产物直接测序。测序结果经BLAST同源性比较后,采用DNAMAN软件进行多重比对分析,以发掘不同样品间DS基因差异位点作为候选SNP。结果 57份人参样本共获得111个符合测序要求的DS基因上下游分段PCR产物,其中测序成功103个,序列经BLAST判定为人参DS基因,经多重比对,发现6个样品存在7个SNP位点。结论建立了巢式PCR-直接测序法发掘人参DS基因cDNA序列的SNP,方法具有特异性好、操作简单、结果准确等优点。可用于检测人参样品的DS基因是否含有SNP及其类型,这可为人参及其相关药材和产品的质量评价新方法研究提供有价值的遗传研究工具和分子标记资源。

AOS1基因克隆及其在鲜切芋头褐变中的表达模式分析

【目的】鲜切芋头即使在低温条件下贮藏,贮藏期间仍会出现变黄变褐的现象,严重影响鲜切芋头的商品性。从鲜切芋头中克隆丙二烯氧化物合成酶(Allene oxide synthase,AOS)基因AOS1,并分析其表达与鲜切芋头褐变的关系,鉴定鲜切芋头褐变过程中的重要功能基因,为鲜切芋头褐变机制研究提供参考。【方法】以鲜切芋头cDNA为模板,采用RT-PCR法克隆AOS1基因编码序列(Coding sequence,CDS);采用荧光定量PCR法分析鲜切芋头褐变过程中AOS1表达情况,利用转录组测序数据分析外源褐变抑制剂处理对AOS1表达的影响,并分析AOS1启动子序列。【结果】20℃条件下,鲜切芋头贮藏24 h切面出现明显的变黄变褐症状,而4℃下贮藏12 d才出现明显的褐变症状,表明贮藏温度是影响鲜切芋头褐变进程的重要因素,低温贮藏可有效抑制鲜切芋头褐变。芋头AOS1基因的CDS全长为1560 bp,编码519个氨基酸残基;AOS1基因编码蛋白质的分子量为57.63 kD,等电点为8.68,定位在叶绿体。植物AOS1蛋白序列相似性较低,芋头AOS1与番茄AOS1、拟南芥AOS1蛋白的亲缘较远,但天南星科植物AOS1蛋白的序列同源性较高。芋头AOS1启动子中含有许多植物激素和逆境响应元件,AOS1表达在鲜切处理后显著上调,表明切分处理诱导了AOS1的表达。随着鲜切芋头褐变进展,AOS1表达量逐渐增加,外源乙醇酸和香草酸处理AOS1表达显著下调,表明AOS1表达与鲜切芋头褐变有关。【结论】鲜切芋头褐变与AOS1表达具有明显正相关性,切分去皮等处理可能通过诱导AOS1表达促进鲜切芋头褐变。

甘蔗丙二烯氧化物合成酶ScAOS的克隆与表达分析

茉莉酸类物质(JAs)作为植物体内的内源生长调节物质,其包括了茉莉酸、茉莉酸甲酯、茉莉酸异亮氨酸及其相关衍生物质,对植物生长发育及抗性防御机制发挥着重要作用。丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)是植物体内茉莉酸生物合成途径的关键酶,影响着茉莉酸类物质的生物合成,进而调节植物的形态建成和防御反应。本研究基于甘蔗转录组数据库,成功克隆到甘蔗丙二烯氧化物合成酶ScAOS的ORF全长序列,利用生物信息学方法了解该基因基本理化性质,并通过qRT-PCR实验分析不同组织和不同胁迫下ScAOS的表达水平差异。生物信息学结果表明,ScAOS基因开放阅读框为1450 bp,编码482个氨基酸,等电点为6.30,不稳定系数为28.4,平均疏水性值为-0.12,预测ScAOS基因编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白。二级结构三级结构预测其元件结构主要为α-螺旋结构和无规则卷曲,该基因含有P450超家族的PLN02648的结构域,属于细胞色素P450基因家族中的CYP74A蛋白家族成员。系统进化树结果显示,ScAOS与高粱处在同一分支上,一致性高达90.4%。qRT-PCR结果显示,ScAOS在甘蔗根茎叶中均有表达,其中在茎中的表达量最高,在叶中的表达量最低。不同胁迫处理的表达差异结果显示,ScAOS均能响应盐害、干旱、植物激素、病虫害等环境胁迫。其中在NaCl、PEG、MeJA、病原菌和黏虫取食胁迫下表达水平均表现持续上升趋势,而在ABA处理下则表现下调趋势。本研究成功克隆到甘蔗ScAOS基因,并通过表达分析发现ScAOS在植物抗性防御方面作用显著。

穗花杉中不存在紫杉醇的化学及分子生物学证据

穗花杉(Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilger)是红豆杉科穗花杉属的一个种。由于穗花杉与红豆杉属植物具有较近的亲缘关系,有研究者认为穗花杉也可以合成紫杉醇,并利用HPLC法测到其含有紫杉醇。但这仅仅是依靠HPLC中出峰时间来判断,并没有质谱结果。该研究利用LC-MS对穗花杉茎叶的化学提取物分析结果显示,穗花杉的茎叶中均未发现紫杉醇。为了进一步证明穗花杉不能合成紫杉醇,该研究利用欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)紫杉醇生物合成关键基因-紫杉二烯合成酶基因(Taxadiene synthase gene,TbTS)的序列TBLASTN比对穗花杉本地转录组,从中找出并克隆得到与TbTS同源性最高的AarTSL1基因;利用原核表达分析AarTSL1基因的编码蛋白,结果发现该基因不具有紫杉二烯合成酶编码基因的功能。该研究从化学和生物学两个方面均证明穗花杉无法合成紫杉醇,为以后通过植物学和化学分类学等研究穗花杉的分类学地位提供了新的有用信息。

人参皂苷前体工程酵母的构建

从人参发根中通过RT-PCR扩增了人参达玛烯二醇合成酶基因。并利用这一基因和酵母表达载体pAUR123构建了产达玛烯二醇的转基因酿酒酵母。阳性克隆经短梗霉素A抗性粗筛,并经PCR、SDS-PAGE和TLC验证。研究结果表明,这一酵母能够表达人参达玛烯二醇合成酶,并产生达玛烯二醇。达玛烯二醇合成酶在整个酵母生长期内均有表达。达玛烯二醇合成酶活和达玛烯二醇水平在YDP液体培养基中培养36 h和42 h时达到最高,分别为132U/g干细胞和251μg/L。

过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响

青蒿素是从草本药用植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯,它是世界卫生组织推荐治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物。本研究采用过表达青蒿素生物合成途径中关键酶基因的方法,培育出青蒿素含量提高的转基因黄花蒿。采用根癌农杆菌介导遗传转化方法,潮霉素抗性筛选获得同时转化HDR和ADS两个基因的转基因黄花蒿;通过基因组PCR检测确认获得了6个共转化HDR和ADS基因的转基因株系。实时荧光定量PCR检测基因表达量,结果表明转基因株系中HDR和ADS基因表达量均高于非转基因植株(仅ah3株系ADS基因表达量没有显著性提高);HPLC测定青蒿素含量结果表明转基因株系中青蒿素含量均高于非转基因植株。青蒿素含量最高的转基因株系ah70中青蒿素含量为非转基因对照的3.48倍。本研究实验结果表明,过表达HDR和ADS基因在黄花蒿的代谢途径中具有提高青蒿素含量的作用,为进一步利用代谢工程技术培育青蒿素高产转基因黄花蒿提供了良好基础。

可见光/路易斯碱协同催化的三氟甲基取代烯烃脱氟硅化反应研究

以三氟甲基取代烯烃为底物,使用硅硼烷为硅自由基供体,开发了一项可见光/路易斯碱协同催化的脱氟硅化反应新技术,实现了多样性偕二氟烯丙基硅砌块的绿色高效合成.新反应以奎宁环为路易斯碱催化剂,通过其对硅硼键的辅助活化促进硅自由基生成,表现出绿色温和、体系简单、易于放大、底物适用范围广和官能团兼容性强等优势.此外,本研究还初步展示了该类合成砌块在多类型含偕二氟甲基结构单元构建中的应用.

粉檀麝香的催化合成

湖南轻工业学院采用路易斯酸作催化剂从松节油合成5-乙酰基-1,1,2,3,3,6-六甲基茚满,即粉檀麝香。合成过程包括在添加路易斯酸的情况下,从α-蒎烯合成单环萜二烯,采用一种催化剂(CNC)从合成得的单环萜二烯合成对异丙基甲苯,从对异丙基甲苯与叔-戊醇合成六甲基茚满。

水稻茉莉酸合成基因OsAOS1在稻瘟病抗性中的功能分析

稻瘟病是水稻生产中的三大病害之一。为探究水稻丙二烯氧化物合成酶基因(Allene Oxide Synthase,OsAOS1)在水稻诱导抗稻瘟病反应中的作用,采用稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)喷雾接种法和叶鞘接种法对突变体osaos1进行了稻瘟病抗性鉴定,结果显示在突变体osaos1中病斑面积和侵染菌丝扩展较野生型明显增多。进一步利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测了OsAOS1在稻瘟病菌接种后的响应情况以及防卫相关基因在野生型和突变体osaos1中的表达差异,结果表明,OsAOS1的表达受稻瘟病菌诱导,且与野生型相比,突变体osaos1中防卫相关基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR10与OsPAL1表达量均显著下调。此外,Os AOS1突变会导致几丁质诱导的ROS积累量降低以及基础免疫标记基因OsKS4和OsPAL的表达量降低。这些结果表明OsAOS1正向调控水稻对稻瘟病的抗性。