6-二甲基氨基嘌呤诱导栉孔扇贝三倍体

用６ － 二甲基氨基嘌呤（６ － ＤＭＡＰ） 处理，对抑制栉孔扇贝第二极体释放产生三倍体的适宜诱导参数进行了试验研究，结合ＤＡＰＩ染色和荧光显微镜观察，分析了开始处理前和处理结束时的受精卵染色体核相组成与三倍体诱导率和幼虫成活率的关系，对三倍体处理组和对照组幼虫的生长进行了观察。结果表明，获得充分成熟的卵子、起始处理时间以第一极体占４０ ％ 、药物浓度６０ ｍｇＬ、持续处理时间１５ ｍｉｎ 及产卵至处理结束保持水温２０ ℃，三倍体诱导率可稳定在８０ ％以上，孵化率达７０ ％ 左右。

6-二甲基氨基嘌呤诱导扇贝异源三倍体

用 6 二甲基氨基嘌呤处理栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂受精卵 ,抑制第二极体释放诱导异源三倍体。水温 17℃下 ,分别进行了不同起始处理时间 (受精后 2 0～ 4 0min)、不同药物处理浓度 (4 0～ 80mg/L)和不同持续处理时间 (5～ 2 0min)的实验。起始处理时间实验以受精后 35min开始处理效果最好 ,三倍体率为 5 1 8% ,D形幼虫成活率可达 78% ;药物处理浓度和持续处理时间最佳组合为 6 0～ 70mg/L 6 DMAP处理 2 0min ,三倍体率可达 5 9 6 5 % ,D形幼虫成活率为 2 2 0 5 %。综合考虑 ,诱导扇贝异源三倍体的适宜参数为 :当 5 0 %受精卵排出第一极体时 ,以 6 0～ 70mg/L 6 DMAP处理 2 0min。

6-二甲基氨基嘌呤诱导泥蚶三倍体实验

于2001年5月,用6-DMAP抑制泥蚶受精卵第二极体的释放诱导三倍体的产生。实验设三个6-DMAP浓度梯度,分别为300μmol/L、450μmol/L、600μmol/L,处理时机为受精卵第一极排放体30％,处理持续时间为10min。结果:三倍体诱导率300μmol/L时为35.5％,450μmol/L时为48.6％,600μmol/L时约为58.5％,另外本实验还就6-DMAP浓度对D形幼虫孵化率和畸形率的影响以及在染色体制片过程中的有关问题进行了初步探讨。

栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体的研究

利用6-二甲基氨基嘌呤(60μg/cm3;6-DMAP)和细胞松弛素B(0.5μg/cm3;CB)抑制受精卵的第1次卵裂,授精后60和65 min分别用CB和6-DMAP持续处理20和15 min,可诱导出12.5%和27.5%的第1卵裂抑制型雌核发育二倍体.细胞学观察显示,6-DMAP抑制第1次卵裂产生的雌核发育二倍体主要在第1次有丝分裂后期的受精卵,由于破坏了纺锤体和阻止了染色体分离,导致一个二倍性雌核的形成,而CB有效地阻止了第1次卵裂的胞质分裂.尽管倍化率和D型幼虫发生率较低,但该研究首次报道了栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体诱导的可行性.

6-DMAP和低渗诱导长牡蛎“海大2号”三倍体的研究

为探索低渗和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)诱导长牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体最佳条件以及6-DMAP和低渗配合使用诱导三倍体的可行性,本研究通过低渗、6-DMAP以及6-DMAP与低渗配合三种方法诱导长牡蛎“海大2号”三倍体。研究显示,低渗处理组中,当第一极体(PB1)出现40%时,在盐度为8的低渗海水中持续处理15 min,综合评价指数最高,为34.33%,此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为73.77%±1.89%和45.78%±6.23%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为50.65%±4.89%和21.17%±5.54%。6-DMAP处理组中,当PB1出现40%时,75 mg/L的6-DMAP持续处理15 min,综合评价指数最高(36.52%),此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为74.81%±0.68%和46.30%±1.54%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为60.37%±0.61%和30.25%±2.85%。6-DMAP和低渗配合组中,当PB1出现40%时,在盐度为8的低渗海水中,以50 mg/L的6-DMAP持续处理15 min,综合评价指数最高(36.18%),此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为74.34%±3.49%和45.07%±4.41%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为68.23%±2.52%和40.42%±4.30%。综合比较以上三种方法,通过6-DMAP和低渗配合诱导获得三倍体的倍率更稳定,幼虫存活率更高。研究结果可为长牡蛎“海大2号”三倍体培育提供参考资料。

6-DMAP诱导太平洋牡蛎三倍体——4.四倍体现象的研究

１９９６～１９９７年，在进行６－二甲基氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）诱导太平洋牡蛎产生三倍体的实验过程中，发现一定数量的四倍体。解剖法获取精卵，人工授精。染色体倍性鉴别采用染色体计数法。（１）三因素四水平Ｌ１６（４５）正交设计。试验平行重复２次。最高四倍体诱导率为４０．０±０．０％。太平洋牡蛎四倍体各诱导因素的最优水平组合：当精卵混合２０ｍｉｎ时，将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１０ｍｉｎ；决定四倍体产生的三因素的主次顺序：６－ＤＭＡＰ浓度→诱导时机→诱导持续时间。（２）三因素三水平Ｌ９（３４）正交设计。试验平行重复３次。最高四倍体诱导率为９．６±４．９％。诱导太平洋牡蛎四倍体各因素的最优水平组合：当５０％受精卵出现第一极体时，将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１５ｍｉｎ；决定四倍体产生的三因素的主次顺序：诱导时机→６－ＤＭＡＰ浓度→诱导持续时间。

牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的研究

比较 3种化学激活方法和 4种电化学激活方法对牛体外成熟卵母细胞进行孤雌激活的效果。结果显示 ,单独用离子霉素和用离子霉素 + 6 DMAP +CB或 +CHX +CB激活牛卵母细胞 ,两者之间差异极显著 (P <0 0 1) ;用不同强度电脉冲 + 6 DMAP +CB激活牛卵母细胞 ,各组间卵裂率差异均不显著 (P >0 0 5 )。结果表明 ,虽然电化学激活方法最高可获得 82 9%的卵裂率 ,比化学激活方法中最好的高 4 8% ,但后者不需电融合仪 ,操作相对简便。

三种化学诱导剂诱导太平洋牡蛎三倍体的比较研究

从三倍体率、D幼孵化率、幼虫生长速度、生产成本等方面比较了细胞松驰素 B、二甲基氨基嘌呤、咖啡因三种化学诱导剂诱导太平洋牡蛎产生三倍体的效果。 CB的三倍诱导率最高 ,为91.5% ,但 D幼孵化率最低 ,仅为 5.8% ,且成本最高 ,为 6 - DMAP和咖啡因的 4倍和 50倍。 6 -DMAP的三倍体诱导率略低于 CB,为 88.0 % ,但 D幼孵化率最高 ,为 6 0 .5% ,其成本仅为 CB的1/ 4。咖啡因的三倍体诱导率最低 ,为 82 .4 % ,幼虫孵化率为 30 .2 % ,但其成本最低 ,仅为 CB的 2 %和 6 - DMAP的 8%。三种诱导剂诱导的三倍体群幼虫在生长速度及成活率方面无显著差别。

不同卵密度对太平洋牡蛎三倍体诱导效果影响的研究

本实验主要研究用70mg/L浓度的6-DMAP(二甲基氨基嘌呤)对太平洋牡蛎的受精卵进行三倍体诱导,研究受精卵的密度对诱导效果的影响,以及诱导后受精卵的孵化率和畸形率。实验结果表明:当受精卵的密度为4万个/ml时三倍体率最高,相应的孵化率最高,综合来看,4万/ml的卵密度是生产上较好的受精卵处理密度。

6-DMAP诱导马氏珠母贝三倍体

用６－二甲基氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）抑制马氏珠母贝（ＰｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉＤｕｎｋｅｒ）受精卵的极体释放获得三倍体。在２６℃条件下，进行了不同浓度梯度的６－ＤＭＡＰ（４０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ）和不同的处理持续时间（５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ）的诱导实验，抑制第一和第二极体的三倍体诱导率最高分别达３２．４％和５７．７％。随着处理强度的加大，三倍体诱导率增高，但孵化率降低。结合三倍体诱导率和幼虫孵化率，以６－ＤＭＡＰ浓度８０ｍｇ／Ｌ、处理持续时间１０ｍｉｎ最好。

太平洋牡蛎三倍体苗种的生产技术

利用细胞松驰素B和 6-二甲基氨基嘌呤二种化学药物 ,分别对太平洋牡蛎受精卵进行处理 ,抑制第二极体排放 ,以诱导产生三倍体 .对药物浓度、处理时机以及处理持续时间三因素及其三种水平进行不完全正交试验 ,筛选出最适药物浓度、处理时机及药物持续时间 ,在此基础上开展规模化生产 ,获得了 62 %的三倍体诱导率 .对三倍体幼虫生长与二倍体幼虫生长进行比较 ,同时开展海上养殖试验 .

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立

目的利用化学激活的技术,建立小鼠孤雌胚胎干细胞系。方法用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理小鼠卵母细胞,待囊胚形成后,分离内细胞团,细胞传代、扩增。待传至37代时,核型检测查染色体,用微卫星技术进行纯合性鉴定,用免疫荧光技术检测胚胎干细胞表面标记Oct-4、SSEA-1及SSEA-4的表达情况,并用畸胎瘤试验检测其多向分化能力。结果该细胞株为孤雌来源,表现为正常二倍体核型,表达ALK,表面标志物Oct-4、SSEA-1阳性,SSEA-4阴性。体内注射后,在局部形成含三个胚层组织的畸胎瘤。结论通过钙离子载体A23187和6-DMAP化学激活小鼠卵母细胞,可以得到具有胚胎干细胞特性的细胞株。

化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果

目的研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况。方法兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5-7d,观察细胞发育与囊胚形成情况。结果钙离子载体A23187激活处理5min后,继续在2.0mmol/L6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0h的卵裂率最高（58.82%,20/34）,并有15%（3/20）的囊胚发育率。透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20min后,均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20min的激活率和卵裂率最高,分别为58.33%（28/48）和63.64%（28/44）。结论兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关。化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响。

6-DMAP对延边黄牛末期卵母细胞核移植的影响

为探讨6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)在延边黄牛末期去核的体细胞克隆中的作用,本试验主要研究了单独使用离子霉素处理与离子霉素联合添加6-DMAP处理对体外成熟的老化延边黄牛卵母细胞的激活率的不同影响;以及不同时期添加6-DMAP对重构胚后期发育能力的影响。试验结果显示,体外成熟的老化卵母细胞,使用离子霉素单独处理后91%被激活,而在离子霉素联合添加6-DMAP处理后却没有细胞被激活,也就是没有第二极体的排出。另外,融合后使用6-DMAP处理,所得重构胚的囊胚发育率最低,而激活后的卵母细胞立即用6-DMAP处理,所得重构胚的发育能力与无6-DMAP处理的相近。综上所述,离子霉素联合添加6-DMAP可抑制老化的延边黄牛卵母细胞的激活,阻止第二极体的排出,但对重构胚的后期发育没有影响。而融合使用添加6-DMAP的培养液,抑制了重构胚的后期发育。

不同化学激活方法对绵羊孤雌生殖胚体外发育的影响

本研究利用常规化学激活剂离子酶素(Ionomycin)和乙醇分别与6-二甲基氨基嘌呤(6-Dimethylaminoputine,6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)的不同组合对绵羊卵母细胞的激活后体外发育效果进行了比较。结果表明:在桑囊胚率上,Ionomycin联合6-DMAP与联合6-DMAP+CB差异不显著(40.4%vs46.0%),而与联合CB组差异显著(40.4%、46.0%vs 29.5%,p<0.05),与单独Ionomycin激活差异极显著(40.4%、46.0%vs 15%,p<0.01);乙醇联合6-DMAP+CB与联合6-DMAP、CB差异显著(46.9%vs 34.2%、36.2%,p<0.05),而与单独乙醇激活差异极显著(46.9%vs 21%,p<0.01)。

三倍体九孔鲍的育种和养成技术研究

当 5 0 %九孔鲍受精卵出现第一极体后 ,以 6 -DMAP为诱导剂 ,用不同的浓度和不同的持续时间抑制第二极体的释放诱导三倍体 ;并进行了生产性苗种培育和养成试验。结果表明 ,6 -DMAP的诱导浓度为30 0μmol·dm-3 、诱导持续时间为 10min时 ,其胚胎的三倍体率为 90 %以上 ,并且胚胎的孵化率高达 85 % ,幼体的畸形率较低 ,为 5 0 %～ 5 5 % ;经过 7个月培育 ,试验组养成鲍的三倍体率为 6 5 %以上 ;试验组养成鲍的平均壳长比对照组增长 10 % ,平均体重比对照组增重 30 %。与二倍体鲍相比较 ,三倍体鲍在壳长增长和体重增重等方面 ,显示了显著的优势 [t>t0 .0 1( 58) ]。

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的：探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法：兔超排后获得卵母细胞体外成熟22-24 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5-7 d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果：卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素＋6-DMAP处理组卵裂率（73.7%）显著高于乙醇＋6-DMAP处理组（38.5%,P〈0.05）;与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论：激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。

硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体育种技术的初步研究

为了获得同时具有杂交及三倍体优势的鲑鳟鱼苗种，开展了利用6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）诱导硬头鳟（Oncorhynchus mykiss）、溪红点鲑（Salvelinus fontinalis）正反杂交受精卵的实验。杂交结果，溪红点鲑（♀）×硬头鳟（♂）实验组卵子在受精10min后全部死亡，而硬头鳟（♀）×溪红点鲑（♂）组的受精卵正常，可以进行6-DMAP三倍体诱导实验。6-DMAP诱导受精卵结果，起始诱导时间在12～15min，受精卵的发眼率最高，为75．87％～76．64％，存5个起始诱导时间梯度内，受精卵的孵化率在86．44％～90.31％之间，苗种三倍体率在92．45％～95．55％之间，差异小显著（P〉0．05）。诱导持续时间为10～15min时，受精卵发眼率达到最高，为74．28％～76．81％，在5个诱导持续时间梯度内，受精卵孵化率在87．28％～90．24％之间，苗种三倍体率在93．67％～96．25％之间，变化不显著（P〉0．05）。药物诱导浓度为120～150mg／L时，受精卵的发眼率达到最高，为73．57％～76．27％，在5个不同的药物浓度梯度内，受精卵孵化率在88．57％～90．03％之间，苗种三倍体率存92．56％～96．38％之间，变化不显著（P〉O．05）。结果表明，利用6-DMAP诱导受精卵制备杂交三倍体苗种的方法是可行的，实验最佳方法为硬头鳟（早）×溪红点鲑（8）卵子受精后12～15min内，利用浓度为120～150mg／L的6-DMAP溶液诱导，持续时间为10～15min，然后放入孵化桶内正常孵化，获得苗种的三倍体率可达92．56％～96．38％，可满足正常生产的需要。