目的:构建并表达鼠源甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)1～84片段的载体,并检测其在促进骨形成中的作用。方法:应用RT-PCR方法体外扩增mPTHrP1～84基因,经测序后重组入原核表达载体pGEX-2TK,将构建正确...目的:构建并表达鼠源甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)1～84片段的载体,并检测其在促进骨形成中的作用。方法:应用RT-PCR方法体外扩增mPTHrP1～84基因,经测序后重组入原核表达载体pGEX-2TK,将构建正确的pGEX-2TK/mPTHrP1～84原核表达载体转化E.coliBL21,IPTG诱导表达。表达产物经蛋白纯化及活性鉴定,通过细胞学实验确定纯化的重组PTHrP片段在促进骨形成中的作用。结果:构建的重组表达载体pGEX-2TK/mPTHrP1～84诱导表达产物以可溶性的形式存在;纯化的mPTHrP1～84可促进小鼠的间充质干细胞向成骨方向增殖和分化。结论:构建、表达的mPTHrP1～84片段可促进骨形成。展开更多
目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC1...目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoR与Sal酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124mg/ml,病毒载体纯度在95%以上。结论实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要。展开更多
目的：探讨脂蛋白相关磷酯酶A2（Lipoprotein Associated Phospholipase A2,Lp-PLA2）、D二聚体（D Dimer,DD）、高敏C-反应蛋白（Hypersensitive C Reative Protein,hsCRP）、外周血嗜中性粒细胞绝对值（Neutrophils Absolute Value，...目的：探讨脂蛋白相关磷酯酶A2（Lipoprotein Associated Phospholipase A2,Lp-PLA2）、D二聚体（D Dimer,DD）、高敏C-反应蛋白（Hypersensitive C Reative Protein,hsCRP）、外周血嗜中性粒细胞绝对值（Neutrophils Absolute Value，Neu）联合检测对急性脑血栓形成（Cerebral Thrombosis，CT）的诊断价值。方法：选取2014年1月至2014年8月佛山市第二人民医院神经内科/外科门诊初诊患者,通过病史、症状和体查拟诊为疑似脑CT患者，再采用诊断金标准将疑似患者（研究对象）确诊分为脑CT（65例）和非脑CT组（50例）。LP-PLA2测定用双抗体夹心ELISA法，DD和hsCRP测定用免疫比浊法，Neu测定用血细胞分析仪法。采用循证检验医学的方法统计各联合指标的诊断价值性能指标。结果：脑CT组Lp-PLA2、DD的ln值、hsCRP的ln值及Neu明显高于非脑CT组[（250.62±145.60）ng/ml vs （152.94±59.01）ng/ml；（2.84±0.33）ng/ml vs （2.06±0.26）ng/ml；（0.55±0.22）mg/l vs （0.24±0.08） mg/l；（4.23±2.05）＆#215;10-9/L vs （3.02±1.38）＆#215;10-9/l，P〈0.05]。Lp-PLA2、DD、hsCRP和Neu对脑CT具有最高诊断正确率的诊断界值分别为173.5ng/ml、330.0ng/ml、1.99mg/ml和3.27＆#215;109/L，依据指标联合诊断价值四格表获得指标并联和串联的各诊断价值参数，4指标并联灵敏度95.4%（漏诊率4.6%）为最高，4指标串联特异性98.0%（误诊率2.0%）为最高，综合考虑单一指标的检测成本和操作方便性，DD和Neu并联灵敏度90.8%（漏诊率9.2%）为最佳，DD和hsCRP串联的特异性94.0%（误诊率4.0%）为最佳。结论：在目前所选择研究指标中,DD＋Neu并联是最佳脑CT筛查联合指标，DD＋hsCRP串联是最佳脑CT确诊联合指标。展开更多
文摘目的:构建并表达鼠源甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)1～84片段的载体,并检测其在促进骨形成中的作用。方法:应用RT-PCR方法体外扩增mPTHrP1～84基因,经测序后重组入原核表达载体pGEX-2TK,将构建正确的pGEX-2TK/mPTHrP1～84原核表达载体转化E.coliBL21,IPTG诱导表达。表达产物经蛋白纯化及活性鉴定,通过细胞学实验确定纯化的重组PTHrP片段在促进骨形成中的作用。结果:构建的重组表达载体pGEX-2TK/mPTHrP1～84诱导表达产物以可溶性的形式存在;纯化的mPTHrP1～84可促进小鼠的间充质干细胞向成骨方向增殖和分化。结论:构建、表达的mPTHrP1～84片段可促进骨形成。
文摘目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoR与Sal酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124mg/ml,病毒载体纯度在95%以上。结论实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要。
文摘目的：探讨脂蛋白相关磷酯酶A2（Lipoprotein Associated Phospholipase A2,Lp-PLA2）、D二聚体（D Dimer,DD）、高敏C-反应蛋白（Hypersensitive C Reative Protein,hsCRP）、外周血嗜中性粒细胞绝对值（Neutrophils Absolute Value，Neu）联合检测对急性脑血栓形成（Cerebral Thrombosis，CT）的诊断价值。方法：选取2014年1月至2014年8月佛山市第二人民医院神经内科/外科门诊初诊患者,通过病史、症状和体查拟诊为疑似脑CT患者，再采用诊断金标准将疑似患者（研究对象）确诊分为脑CT（65例）和非脑CT组（50例）。LP-PLA2测定用双抗体夹心ELISA法，DD和hsCRP测定用免疫比浊法，Neu测定用血细胞分析仪法。采用循证检验医学的方法统计各联合指标的诊断价值性能指标。结果：脑CT组Lp-PLA2、DD的ln值、hsCRP的ln值及Neu明显高于非脑CT组[（250.62±145.60）ng/ml vs （152.94±59.01）ng/ml；（2.84±0.33）ng/ml vs （2.06±0.26）ng/ml；（0.55±0.22）mg/l vs （0.24±0.08） mg/l；（4.23±2.05）＆#215;10-9/L vs （3.02±1.38）＆#215;10-9/l，P〈0.05]。Lp-PLA2、DD、hsCRP和Neu对脑CT具有最高诊断正确率的诊断界值分别为173.5ng/ml、330.0ng/ml、1.99mg/ml和3.27＆#215;109/L，依据指标联合诊断价值四格表获得指标并联和串联的各诊断价值参数，4指标并联灵敏度95.4%（漏诊率4.6%）为最高，4指标串联特异性98.0%（误诊率2.0%）为最高，综合考虑单一指标的检测成本和操作方便性，DD和Neu并联灵敏度90.8%（漏诊率9.2%）为最佳，DD和hsCRP串联的特异性94.0%（误诊率4.0%）为最佳。结论：在目前所选择研究指标中,DD＋Neu并联是最佳脑CT筛查联合指标，DD＋hsCRP串联是最佳脑CT确诊联合指标。
