基于二硫键还原酶异源表达与优化的羽毛废弃物双酶协同降解及应用

富含角蛋白的羽毛废弃物是一种潜在的优质蛋白资源,但缺乏有效的回收方式。角蛋白酶可催化降解羽毛废弃物产生氨基酸和多肽等高价值水解产物,被认为是一种极具潜力的废弃角蛋白回收方式。然而,角蛋白酶较低的二硫键还原活性却成为限制羽毛水解效率的瓶颈问题。该研究通过二硫键还原酶破坏羽毛角蛋白的二硫键,与角蛋白酶协同作用加速羽毛废弃物的降解。首先,在Bacillus subtilis WB600中异源表达来源于Bacillus subtilis 168的4种二硫键还原酶,并对其酶学性质进行表征;进而通过优化二硫键还原酶MsrA的信号肽,提高了其胞外表达量;最后,探究了二硫键还原酶与角蛋白酶KerZ1协同降解羽毛的效果,分析了水解液中氨基酸的种类和含量。二硫键还原酶AhpC、DLD、MsrA和TrxR成功实现了胞外表达,比酶活力分别为0.53、1.69、16.7、2.06 U/mg;MsrA携带信号肽YxkH时胞外二硫键还原酶活性提高了4.2倍;MsrA+KerZ1降解羽毛的水解液中可溶性蛋白含量是KerZ1单独降解时的3倍;优化后的MsrA+KerZ1降解100 g/L的鸭毛和鸡毛,水解液中氨基酸含量分别为7472.33、5589.67 mg/L;另外,使用羽毛水解液浇灌的玉米植株拥有更粗壮的茎和更发达的根系,表明水解液中的营养物质可显著促进植物生长。二硫键还原酶显著促进了角蛋白酶降解羽毛的效率,其与角蛋白酶协同作用的降解体系为羽毛废弃物的高效回收奠定了工作基础。

枯草芽孢杆菌中一个受二硫键还原剂诱导并与伸长因子Tu同源的蛋白质

分析了β-巯基乙醇（β-ME）和二硫苏糖醇（DTT）对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis细胞蛋白质组分的影响。在LB培养基中，β-ME和DTT处理能诱导一个50kD蛋白质（P50）的合成。在正常生长条件下P50是一个组成性（constitutive）成的细胞质蛋白质。热激也能诱寻P50，但是孢子形成（sporulation）不能诱导P50。在Schaeffer孢子形成培养基中，β-ME和DTT都不能诱导P5O，表明二硫键还原剂诱导P50的能力依赖于特定的生理条件。用VS蛋白酶有限降解P50，得到4个主要的多肽片段，测定了其中两个片段的N-端氨基酸序列。同源性检索发现P50高度同源于蛋白质合成的伸长因子Tu。

耐热醋酸棱状芽孢杆菌中具有高的二硫键还原活性组分的提取和特性研究

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ层析柱从Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ细胞提取物中分离出的两个具有相近分子量（７００）的活性组分，在ＭＶ＋存在下，对二硫键具有高的催化还原活性．这两组分参与的催化还原反应不以ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ为电子供体．在实验条件下，对二硫键的催化还原活性顺序为：ＧＳＳＧ＞硫辛酰胺＞胱氨酸＞硫辛酸．活性组分具有较高的反应稳定性和热稳定性．两组分在２６０、３５４和５０５（４６５）ｎｍ处具有特征吸收峰．

嗜麦芽窄食单胞菌胞内具二硫键还原活性酶蛋白的研究

研究旨在克隆并表达嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞内具二硫键还原活性的酶蛋白。以Stenotrophomonas maltophilia基因组DNA为模板,扩增目的基因谷胱甘肽还原酶(Glr),构建重组质粒p ET-22b-Glr,并转化到表达菌株BL21(DE3)中得到重组菌,经IPTG诱导表达后,测定二硫键还原酶活性。结果表明,该重组酶基因大小为1 359 bp,酶活力为1.85 U/mg。酶学性质研究表明,重组谷胱甘肽还原酶的最适反应p H值为6.0,最适反应温度为40℃。对角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究表明,该酶对其降解羽毛促进率为15%。结果揭示了Stenotrophomonas malto-philia胞内液具有促进胞外液角蛋白水解活性的内在机制。

清热祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠二硫键A样氧化还原酶蛋白表达的影响

目的:观察清热祛湿活血方对高糖高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型大鼠血浆脂联素(APN)、脂肪组织二硫键A样氧化还原酶蛋白(DsbA-L)等指标的影响。方法:将30只大鼠随机分为观察空白对照组(A组)、模型对照组(B组)和中药组(C组),每组各10只。造模成功后,C组取中药煎剂按每日10 mL·kg-1剂量灌胃,A组和B组用相同体积的生理盐水灌胃。观察各组大鼠治疗前、治疗后体质量的变化和治疗后肝指数变化;光镜观察大鼠肝脏病理学变化。结果:中药组体质量与模型对照组治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药组大鼠体质量与空白对照组治疗前比较,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型对照组和空白对照组治疗后比较,中药组大鼠体质量及肝指数显著低于模型对照组,;血浆APN和脂肪组织DsbA-L的表达水平显著高于空白对照组和模型对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);光镜下观察模型对照组肝细胞脂肪变性明显而广泛,肝细胞结构紊乱,而中药组肝组织结构正常。结论:清热祛湿活血方能降低非酒精性脂肪肝模型大鼠体质量及肝指数,显著改善肝组织损害,可能与该方能够显著促进大鼠脂肪组织DsbA-L的表达,进而促进脂联素的表达有关。

二硫键A氧化还原酶样蛋白对脂联素的调控机制研究进展

近年来,二硫键A氧化还原酶样蛋白作为一个新发现的分子伴侣已被证实与脂联素的分泌、合成及多聚化各个环节关系密切。部分研究发现,二硫键A氧化还原酶样蛋白能够促进脂联素的表达,Akt/FOXO1和AMPK信号途径在该蛋白对脂联素的调控机制中可能起到了关键作用。进一步明确二硫键A氧化还原酶样蛋白调控脂联素的机制,对寻找治疗糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢紊乱疾病的新靶点具有重要意义。

白藜芦醇在调控二硫键氧化还原酶类似蛋白基因表达中的作用

目的探讨白藜芦醇对二硫键氧化还原酶类似蛋白(DsbA-L)基因转录的影响。方法将25μmol/L白藜芦醇加入HepG2细胞和3T3-L1细胞,干预24h后收获细胞,用于后续实验提取RNA和蛋白;以二甲基亚砜(DMSO)处理组作为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹法检测3T3-L1细胞和HepG2细胞DsbA-L mRNA和蛋白表达水平。以荧光素酶报告基因实验分析白藜芦醇对DsbA-L基因启动子活性的影响。采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测白藜芦醇对转录因子Sp1与DsbA-L基因内含子1区域Sp1结合位点的结合能力的影响。采用Western印迹法检测Sp1蛋白表达水平。结果在3T3-L1细胞和HepG2细胞中,白藜芦醇处理组DsbA-L蛋白和DsbA-L mRNA的表达水平均显著高于DMSO对照组(P值均<0.05)。白藜芦醇处理组的DsbA-L基因启动子报告基因质粒p(-186to+432)Luc的相对荧光素酶活性显著高于DMSO对照组(P<0.05);与包含该Sp1结合位点的DsbA-L基因启动子报告基因质粒p(-186to+432)Luc相比,不包含该Sp1结合位点的两个报告基因质粒,Sp1位点缺失突变的p(-186to+432)Luc mut和3’端部分缺失的p(-186to+391)Luc在白藜芦醇干预后的相对荧光素酶活性与DMSO对照组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。与DMSO对照组相比,白藜芦醇处理后转录因子Sp1与DsbA-L基因内含子区DNA特异结合形成的DNA-Sp1复合物的条带灰度减弱。白藜芦醇处理后3T3-L1细胞和HepG2细胞中Sp1的蛋白表达均显著低于DMSO对照组(P值均<0.05)。结论白藜芦醇通过抑制Sp1表达,上调DsbA-L基因的转录,从而促进DsbA-L蛋白的表达。

二硫键氧化还原酶类似蛋白的研究进展

二硫键氧化还原酶类似蛋白(DsbA-L)是一个最近发现的与脂联素相互作用的关键蛋白,它具有明显上调高相对分子质量脂联素水平及增强胰岛素敏感性的重要功能。DsbA-L水平与肥胖症以及内质网应激呈负相关,并能缓解由内质网应激诱导的脂联素水平下降。因此,DsbA-L是一个具有广泛前途的药物新靶点,而有效地调节DsbA-L的表达可能为治疗各种代谢疾病提供一个新的途径。

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的克隆Dsb A-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Dsb A-L基因5'端2115bp片段(从翻译起始点ATG上游-2128^-14区域)。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体p GL3-basic。随后,构建5'端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果成功构建人Dsb A-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128^-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人Dsb A-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论成功构建人Dsb A-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。

大肠杆菌二硫键氧化还原酶

真核生物中正确二硫键的形成是在内质网中由二硫键异构酶PDI及相关蛋白催化的,而在原核生物大肠杆菌中二硫键的氧化、还原和异构化发生在细胞周质,由一系列的二硫键氧化还原酶完成。从1991年Badewell发现第一个氧化还原蛋白DsbA开始,目前已发现有七种二硫键氧化还原酶。DsbB、DsbD、DsbE/CcmG及CcmH位于细胞膜上,DsbA、DsbC、DsbG在细胞周质空间中。DsbA和DsbB的氧化和电子传递链相联系,而DsbC、DsbD、DsbE、DsbG和CcmH的还原需要来自细胞质的电子传递。

角蛋白降解菌分离、鉴定及其降解机制研究

实验旨在筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,并对其降解羽毛角蛋白机制进行研究,为提高角蛋白生物降解率提供理论指导。采用透明圈和完整羽毛降解相结合的方法,从废弃羽毛中筛选角蛋白降解菌,并进一步研究其羽毛角蛋白降解过程。获得一株可高效降解角蛋白菌株,基于形态观察和16S rDNA分子鉴定,该菌被命名为Bacillus licheniformis CP-7,其5 d可将天然完整羽毛完全降解。CP-7发酵过程产生大量巯基、可溶性蛋白和亚硫酸盐。分离发酵48 h菌株胞内、胞外粗酶液,发现胞外酶液具有较高的角蛋白酶活性,而胞内酶液具有一定二硫键还原酶活性。胞内酶液能够极显著地促进胞外酶液水解角蛋白活性(P<0.01),但对酪蛋白水解活性无影响(P>0.05)。筛选菌CP-7为具有高二硫键还原能力的角蛋白降解菌,二硫键还原酶可能是高效降解羽毛角蛋白的关键。

角蛋白水解酶的研究进展

蛋白质饲料资源短缺一直是困扰我国饲料工业发展的瓶颈问题。近年来,我国饲料工业发展迅猛,年产配合饲料总量突破1.07亿吨,已成为世界第二大饲料生产国。与此同时,我国饲料工业所面临的矛盾与问题也愈显突出。饲料资源短缺现象越来越严重,我国每年饲料原料进口数量和成本不断攀升,特别是蛋白质饲料资源自给问题异常突出。目前。

小麦面筋蛋白含半胱氨酸小麦肽的富集与表征

小麦面筋蛋白经过胃蛋白酶的处理产生有活性的含半胱氨酸小麦肽,半胱氨酸具有多种生理功能,已广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。该文首先考察了还原处理对小麦面筋蛋白胃蛋白酶酶解物中含半胱氨酸小麦肽的影响。其次采用巯丙基树脂Sepharose 6B对含半胱氨酸小麦肽进行富集,巯基含量由原来的(195.10±12.79)μmol/g蛋白上升至(994.95±9.31)μmol/g蛋白,富集的肽组分中48.46%的肽段相对分子质量> 5 000 Da,而<1 000 Da小分子组分占比最少为7.93%,此外富集之后肽段的疏水性增大。利用单溴二胺对含半胱氨酸小麦肽进行荧光标记,标记之后的含半胱氨酸小麦肽相对分子质量在300~10 k Da,但相对分子质量<1 000 Da的组分中疏水性部分对荧光的贡献值大于其他组分。

组合酶水解羽绒加工副产物工艺参数的优化

本研究旨在对来源于地衣芽孢杆菌CP-16的重组角蛋白酶和二硫键还原酶协同酶解羽绒加工副产品最佳工艺条件进行探讨。试验探讨角蛋白酶与二硫键还原酶组合水解羽毛角蛋白的适宜比例,并研究蒸汽压力处理时间、酶解时间、组合酶添加水平和水分含量等单一因素对酶解效率的影响,再利用L9(34)正交试验进一步优化处理工艺条件。结果显示,当角蛋白酶与二硫键还原酶的酶活比例为80∶1,角蛋白酶终浓度为90 U/mL时,组合酶酶解羽绒加工副产品效率最佳;经压力处理2 h更有利于提高酶解效率;水解60 h酶解率最高,但与48 h差异不显著(P>0.05);总反应体系中缓冲液为5.5 mL时酶解效率显著高于对照组(P<0.05),但与4.5 mL组差异不显著(P>0.05)。正交试验优化酶解羽绒加工副产品条件发现,影响组合酶酶解效率的因素由大到小依次为压力处理时间、酶解时间、酶剂量;酶解羽绒加工副产品最适条件为:角蛋白酶与二硫键还原酶活性比例为80∶1,121℃高压处理2 h,角蛋白酶终浓度为90 U/mL,50℃酶解48 h,此时1 g羽绒加工副产品产生的上清液可溶性蛋白含量为352.72 mg,比对照组提高640.26%。综上,利用多种处理工艺相结合更有利于提高组合酶水解羽绒加工副产品的效率。本试验结果可为羽绒加工副产品资源开发利用提供理论指导。

猪毛角蛋白降解菌的分离筛选及其降解特性研究

为了筛选能高效降解猪毛角蛋白的微生物,该研究利用猪毛角蛋白为唯一碳氮源的培养基从土壤中分离角蛋白降解菌,并对其菌种分类及降解角蛋白的特性进行了研究。通过驯化共筛选到6株能够降解猪毛角蛋白的菌株,经过7 d发酵培养,菌株X-3对猪毛角蛋白的降解率达77.3%,降解效果最佳。结合菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA发育进化树分析,初步鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。菌株X-3是一株广谱的角蛋白降解菌,对猪毛、羊毛、鸡毛、鹅毛、鸭毛的降解率均大于60%。该菌株在角蛋白底物作用下可产生角蛋白酶和二硫键还原酶,且酶活与猪毛角蛋白降解率变化存在显著的正相关性,表明菌株X-3产生的角蛋白酶和二硫键还原酶在角蛋白降解中起到非常关键的作用。在降解过程中,产生了大量的可溶性蛋白,二硫键中的硫也随之转化为硫酸盐、亚硫酸盐和巯基化合物,其中硫酸盐是主要的转化形式。该菌株的分离筛选丰富了猪毛角蛋白降解菌的微生物资源库,在氨基酸饲料生产中具有潜在的应用价值。

二硫键氧化还原异构酶(DsbM)与转录调控因子(PA0056)的相互作用

二硫键氧化还原异构酶(disulfide oxidoreductase,DsbM)分布于原核细胞中,主要参与周质空间中膜蛋白的折叠.转录调控因子(lysR type transcriptional regulator,PA0056)是一类包含4个半胱氨酸的蛋白,当以氧化态形式存在时,可调控下游基因的转录,参与调节抗氧化或者抗药性.本实验室前期研究证明DsbM参与氨基糖苷类耐药性的调节.关注铜绿假单胞菌中DsbM和PA0056之间的相互作用,分别构建了酵母双杂交(yeast two-hybrid test)和双分子荧光互补系统(bi-molecular fluorescence complementation, BiFC)的载体.通过酵母双杂交实验,发现DsbM和PA0056之间存在较强的蛋白质相互作用.通过BiFC实验,发现共同转化表达DsbM和PA0056载体的酵母中可观察到强烈的黄色荧光,表明DsbM和PA0056可以发生相互作用.本研究为深入研究DsbM在铜绿假单胞菌耐氨基糖苷类抗生素耐药机制奠定基础.

嗜热角蛋白降解菌的分离筛选及降解特性

为获得高效降解羽毛角蛋白的嗜热微生物,提高微生物降解角蛋白的效率,利用以羽毛角蛋白为唯一碳氮源的培养基从堆肥样品中分离降解菌,并对其菌种分类、粗酶液的酶学性质及降解角蛋白机理进行研究。通过选择培养基共筛选到5株高温降解菌,其中,菌株K-7降解性能和生物安全性能最佳。结合菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA系统进化树分析,鉴定该菌株为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。在含角蛋白底物培养基中,K-7的发酵上清液可检测到较强的角蛋白酶活,但未检测到明显的二硫键还原酶活;同时,在降解过程中,产生了大量的亚硫酸盐和巯基化合物,表明亚硫酸盐裂解是角蛋白二硫键断裂的主要方式。酶学特性结果显示,粗酶液的最适反应温度为50~70℃,最适反应pH值为7.0~8.0,粗酶液在80℃以下时热稳定较好,SDS、PMSF和EDTA等化学试剂对酶活有较强的抑制作用,而DTT、β-巯基乙醇对酶活性有显著的增强作用。研究结果扩展了副地衣芽孢杆菌的应用领域,丰富了嗜热角蛋白降解菌的菌种资源库。

ERP57、ERAP1在乳腺癌中的表达及与临床病理特征的关系

目的观察女性乳腺癌中巯基二硫键氧化还原酶(ERP57)、抗原处理相关内质网氨肽酶(ERAP1)的表达情况,探讨其与乳腺癌各临床病理指标的关系。方法选取2011年1月—2015年12月于新疆医科大学附属肿瘤医院收集的124例乳腺癌肿瘤和24例乳腺纤维腺瘤组织标本,应用免疫组织化学SP法检测标本中ERP57及ERAP1的表达情况;根据临床病理参数对患者进行分组,分析各组之间ERP57、ERAP1的表达有无差异。结果ERP57在乳腺癌及乳腺纤维腺瘤中阳性表达率分别为58.8%(73/124)和100%(24/24),差异有统计学意义(χ~2=15.061,P<0.05);ERAP1阳性表达率分别为47.5%(59/124)和83.3%(20/24),差异有统计学意义(χ~2=10.328,P<0.05)。乳腺癌组织中ERP57、ERAP1阳性表达率比较,无腋窝淋巴结转移患者高于有腋窝淋巴结转移患者,组织学分级Ⅰ级患者高于Ⅱ~Ⅲ级患者,TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者高于Ⅲ~Ⅳ期患者,差异均有统计学意义(均P<0.05)。此外,乳腺癌组织中ERAP1阳性表达率比较,>35岁患者高于≤35岁患者。Ki67阳性率≤14%患者高于>14%患者,非三阴性患者高于三阴性患者,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 ERP57、ERAP1蛋白低表达可能与乳腺癌的发生关系密切,这对判断乳腺癌恶性程度及预后有一定的参考价值。

粒径可控型中空介孔SiO_(2)基纳米药物载体材料的设计与性能

本文以聚丙烯酸(PAA)、正硅酸乙酯(TEOS)、硅烷偶联剂Si-69为主要原料,异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光剂,利用自模板法制备具有荧光标记的中空介孔SiO_(2)纳米载体(HMSNs-69-FITC)。通过FTIR、DLS、BET、Raman和TEM对纳米载体的结构、粒径进行测定,用紫外分光光度计和TEM对其还原敏感性能进行表征,用溶剂挥发法负载索拉非尼(SOR),并计算其负载效率。研究结果表明:调控PAA的量可以实现HMSNs在28~380 nm范围内粒径可控,其中,0.024 g/mL PAA、平均粒径100 nm的HMSNs稳定性能优良,HMSNS-69-FITC对SOR的负载效率为280.0μg/mg,在含有0.0083 g/mL二硫苏糖醇(DTT)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液中,48 h累计释放率约为82.4%;而无DTT时,48 h累计释放率约为25.1%,该载体具有二硫键还原敏感性。此工作有助于推动粒径可控的、还原敏感型SiO2纳米载体领域的研究。