清热祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠二硫键A样氧化还原酶蛋白表达的影响

目的:观察清热祛湿活血方对高糖高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型大鼠血浆脂联素(APN)、脂肪组织二硫键A样氧化还原酶蛋白(DsbA-L)等指标的影响。方法:将30只大鼠随机分为观察空白对照组(A组)、模型对照组(B组)和中药组(C组),每组各10只。造模成功后,C组取中药煎剂按每日10 mL·kg-1剂量灌胃,A组和B组用相同体积的生理盐水灌胃。观察各组大鼠治疗前、治疗后体质量的变化和治疗后肝指数变化;光镜观察大鼠肝脏病理学变化。结果:中药组体质量与模型对照组治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药组大鼠体质量与空白对照组治疗前比较,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型对照组和空白对照组治疗后比较,中药组大鼠体质量及肝指数显著低于模型对照组,;血浆APN和脂肪组织DsbA-L的表达水平显著高于空白对照组和模型对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);光镜下观察模型对照组肝细胞脂肪变性明显而广泛,肝细胞结构紊乱,而中药组肝组织结构正常。结论:清热祛湿活血方能降低非酒精性脂肪肝模型大鼠体质量及肝指数,显著改善肝组织损害,可能与该方能够显著促进大鼠脂肪组织DsbA-L的表达,进而促进脂联素的表达有关。

二硫键A氧化还原酶样蛋白对脂联素的调控机制研究进展

近年来,二硫键A氧化还原酶样蛋白作为一个新发现的分子伴侣已被证实与脂联素的分泌、合成及多聚化各个环节关系密切。部分研究发现,二硫键A氧化还原酶样蛋白能够促进脂联素的表达,Akt/FOXO1和AMPK信号途径在该蛋白对脂联素的调控机制中可能起到了关键作用。进一步明确二硫键A氧化还原酶样蛋白调控脂联素的机制,对寻找治疗糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢紊乱疾病的新靶点具有重要意义。

白藜芦醇在调控二硫键氧化还原酶类似蛋白基因表达中的作用

目的探讨白藜芦醇对二硫键氧化还原酶类似蛋白(DsbA-L)基因转录的影响。方法将25μmol/L白藜芦醇加入HepG2细胞和3T3-L1细胞,干预24h后收获细胞,用于后续实验提取RNA和蛋白;以二甲基亚砜(DMSO)处理组作为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹法检测3T3-L1细胞和HepG2细胞DsbA-L mRNA和蛋白表达水平。以荧光素酶报告基因实验分析白藜芦醇对DsbA-L基因启动子活性的影响。采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测白藜芦醇对转录因子Sp1与DsbA-L基因内含子1区域Sp1结合位点的结合能力的影响。采用Western印迹法检测Sp1蛋白表达水平。结果在3T3-L1细胞和HepG2细胞中,白藜芦醇处理组DsbA-L蛋白和DsbA-L mRNA的表达水平均显著高于DMSO对照组(P值均<0.05)。白藜芦醇处理组的DsbA-L基因启动子报告基因质粒p(-186to+432)Luc的相对荧光素酶活性显著高于DMSO对照组(P<0.05);与包含该Sp1结合位点的DsbA-L基因启动子报告基因质粒p(-186to+432)Luc相比,不包含该Sp1结合位点的两个报告基因质粒,Sp1位点缺失突变的p(-186to+432)Luc mut和3’端部分缺失的p(-186to+391)Luc在白藜芦醇干预后的相对荧光素酶活性与DMSO对照组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。与DMSO对照组相比,白藜芦醇处理后转录因子Sp1与DsbA-L基因内含子区DNA特异结合形成的DNA-Sp1复合物的条带灰度减弱。白藜芦醇处理后3T3-L1细胞和HepG2细胞中Sp1的蛋白表达均显著低于DMSO对照组(P值均<0.05)。结论白藜芦醇通过抑制Sp1表达,上调DsbA-L基因的转录,从而促进DsbA-L蛋白的表达。

二硫键氧化还原酶类似蛋白的研究进展

二硫键氧化还原酶类似蛋白(DsbA-L)是一个最近发现的与脂联素相互作用的关键蛋白,它具有明显上调高相对分子质量脂联素水平及增强胰岛素敏感性的重要功能。DsbA-L水平与肥胖症以及内质网应激呈负相关,并能缓解由内质网应激诱导的脂联素水平下降。因此,DsbA-L是一个具有广泛前途的药物新靶点,而有效地调节DsbA-L的表达可能为治疗各种代谢疾病提供一个新的途径。

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的克隆Dsb A-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Dsb A-L基因5'端2115bp片段(从翻译起始点ATG上游-2128^-14区域)。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体p GL3-basic。随后,构建5'端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果成功构建人Dsb A-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128^-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人Dsb A-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论成功构建人Dsb A-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。

PC12细胞谷胱甘肽二硫键氧化还原酶cDNA的克隆表达与序列分析

目的获得PC12细胞谷胱甘肽二硫键氧化还原酶全长cDNA及表达的蛋白质,分析比较该cDNA及外推的蛋白质序列。方法用逆转录PCR(RT鄄PCR)获得该蛋白cDNA并将其分别克隆和亚克隆于PUC18和PQE31载体,受体细胞为BL21。亲和层析分离重组蛋白,SDS电泳分析表达产物。结果PC12细胞谷胱甘肽二硫键氧化还原酶全长cDNA含324个碱基,编码含107个氨基酸的蛋白质,并与小鼠和人的该序列有高度同源性,获得了具有活性的谷胱甘肽二硫键氧化还原酶。结论构建了PC12细胞谷胱甘肽二硫键氧化还原酶cDNA在大肠杆菌细胞的克隆表达体系;测定了该蛋白cDNA序列并推导出它的氨基酸排列顺序;证明了该蛋白与人和小鼠具有高度同源性。

醛糖还原酶类似蛋白1在293T细胞的表达降低由丙烯醛引起的氧化应激

目的研究ARL-1在293T细胞内的表达由丙烯醛引起氧化应激的影响。方法通过构建EGFP/ARL-1融合蛋白表达载体,将表达载体转染293T细胞,获得具有EGFP/ARL-1表达的293T细胞;使用分子探针CM-H2D-CFDA检测293T细胞内活性氧水平,并用流式细胞仪对荧光进行定量。结果在10μmol/L丙烯醛作用下,293T对照细胞内荧光密度比值为530%±36%,是无药物处理293T对照组细胞的4倍;而在有EGFP/ARL-1表达的293T细胞中荧光密度比值为220%±20%,是无药物处理有EGFP/ARL-1表达的293T细胞的2倍。结论ARL-1在293T细胞内的表达能非常有效的减少由丙烯醛所引起的氧化应激。

大肠杆菌二硫键氧化还原酶

真核生物中正确二硫键的形成是在内质网中由二硫键异构酶PDI及相关蛋白催化的,而在原核生物大肠杆菌中二硫键的氧化、还原和异构化发生在细胞周质,由一系列的二硫键氧化还原酶完成。从1991年Badewell发现第一个氧化还原蛋白DsbA开始,目前已发现有七种二硫键氧化还原酶。DsbB、DsbD、DsbE/CcmG及CcmH位于细胞膜上,DsbA、DsbC、DsbG在细胞周质空间中。DsbA和DsbB的氧化和电子传递链相联系,而DsbC、DsbD、DsbE、DsbG和CcmH的还原需要来自细胞质的电子传递。

MIF活性区域相互作用蛋白的筛选

目的:筛选与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)催化巯基蛋白质氧化还原酶(TPOR)活性域相互结合的蛋白。方法:采用酵母双杂交系统进行筛选。首先构建pBTM116-MIF诱饵质粒,转化酵母菌株L40;将表达MIF催化TPOR活性域的L40酵母菌株制备成感受态菌,在人骨肉瘤cDNA文库中筛选。通过组氨酸(HIS3报告基因活性和β半乳糖苷酶实验,初步确定与催化TPOR活性域片段相互作用的蛋白,最终通过免疫共沉淀和免疫荧光技术来确认。结果:分别构建含野生型MIF的pBTM116-MIF和野生型硫氧还蛋白样蛋白2(TXNL2)的pACT2-TXNL2质粒,将其共转染L40酵母菌。HIS3报告基因活性检测和β半乳糖苷酶阳性实验结果提示TXNL2可能是与MIF催化TPOR活性片段相互作用的蛋白。将重组质粒pcDNA3.1-Myc-TXNL2转染MCF7细胞,免疫共沉淀实验结果表明MIF抗体能够共沉淀Myc-TXNL2蛋白;免疫荧光结果显示Myc-TXNL2与MIF在细胞质中位置分布相同。结论:TXNL2可能是与MIF催化TPOR活性片段相互作用的蛋白。本研究为MIF氧化还原机制的研究提供了新的实验依据。

共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响

探索共表达蛋白质折叠辅助因子Ero1、PDI和Bi P对毕赤酵母GS115分泌表达融合蛋白质IFNβ-HSA的影响。将构建的蛋白质折叠辅助因子表达载体p GAP-Ero1、p GAP-PDI、p GAPBi P和空载对照线性化后,电击转化重组毕赤酵母GS115/IFNβ-HSA细胞,用含有400μg/m L zeocin的YPD平板筛选阳性转化子,并采用PCR和Western blot法进一步鉴定。阳性转化子进行摇瓶发酵后,采用SDS-PAGE及Western blot法分析共表达Ero1、PDI和Bi P对IFNβ-HSA表达水平的影响。结果表明,Ero1、PDI和Bi P成功地在胞内过量表达,且不影响宿主细胞的正常生长;共表达Ero1和PDI分别使IFNβ-HSA的表达量提高了80%和90%,而共表达Bi P则对IFNβ-HSA的表达水平无明显影响。

昆布散对甲状腺肿大大鼠甲状腺功能及氧化应激的影响

目的观察昆布散对甲状腺肿大大鼠甲状腺功能、氧化应激及Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、血红素氧合酶1(HO-1)、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1(NQO-1)蛋白表达的影响。方法将72只大鼠随机分成6组:正常组、模型组、左甲状腺素钠组、昆布散低剂量组、昆布散中剂量组、昆布散高剂量组,除正常组大鼠外,其余各组大鼠连续灌服丙硫氧嘧啶14 d,形成甲状腺肿大模型。各组大鼠灌胃给药28 d后,称量甲状腺湿重,计算甲状腺系数;测定大鼠血清中碘甲状原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)水平及甲状腺中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;Western Blot检测大鼠甲状腺Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1、血红素氧合酶1、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1蛋白的表达。结果与模型组比较,昆布散治疗组大鼠的血清碘甲状原氨酸、甲状腺素、甲状腺超氧化物歧化酶及Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),同时血清促甲状腺激素、甲状腺丙二醛及血红素氧合酶1、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01),其作用与左甲状腺素钠相当。结论昆布散可显著改善甲状腺肿大大鼠甲状腺激素分泌水平,抑制氧化应激损伤,其作用机制可能与调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1/血红素氧合酶1/磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1通路有关。

葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用观察

目的观察葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用,并探讨可能作用机制。方法50只SD肥胖大鼠,腹腔注射1%链脲佐菌素(40 mg/kg),41只成功建成糖尿病大鼠模型,随机分为DM组8只、CM组9只、葡萄籽原花青素提取物低剂量组8只、中剂量组8只、高剂量组8只,另取10只肥胖大鼠为空白对照组(NC组),1 mL/kg腹腔注射柠檬酸缓冲液;低、中、高剂量组大鼠每日分别用50、250、500 mg/kg的葡萄籽原花青素提取物灌胃1次,连续3天,第3天灌胃24 h时尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg);NC组、DM组、CM组大鼠每日用10 mL/kg生理盐水灌胃1次,第3天灌胃24 h时,NC组、DM组尾静脉注射5 ml/kg生理盐水;CM组尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg)。末次给药48 h时各组大鼠断尾采血,检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),采血后处死各组大鼠,取肾组织检测肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),采用原位缺口末端标记法测算各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数,采用Western Blotting法检测各组大鼠肾组织核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)通路相关醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素单加氧酶-1(HO-1)、Nrf2、Keap1蛋白。结果与NC组比较,CM组及低剂量组血清SCr、BUN水平高(P均<0.05)。与CM组比较,NC组、DM组、低中高剂量组血清SCr、BUN水平低(P均<0.05);与低剂量组比较,中、高剂量组大鼠血清SCr、BUN水平低(P均<0.05)。与NC组比较,DM组、CM组、低中剂量组肾组织匀浆SOD水平低,DM组、CM组及低剂量组肾组织匀浆MDA水平高(P均<0.05)。与CM组比较,DM组、低中高剂量组肾组织匀浆组SOD水平高、MDA水平低(P均<0.05)。与CM组比较,中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数小(P均<0.05)。与NC组比较,CM组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低,中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与CM组比较,低中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与中剂量组比较,低剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论葡萄籽原花青素提取物可改善尾静脉注射造影剂糖尿病大鼠的肾损伤程度,且500 mg/kg时效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通过激活Nrf2—Keap1信号通路,预防造影剂诱导的糖尿病大鼠的急性肾损伤。

路漫漫,阿尔茨海默病药物治疗尚待求索

药物治疗阿尔茨海默病路漫漫,尚待求索。痴呆(Dementia)是一种表现在记忆、认知行为和人格改变的临床综合征。世界人口正在老龄化,“银发群体”不断壮大,使得老年期痴呆的发病率正在日益增加。依据其临床和病理的特征,老年期痴呆又分为以进行性大脑功能障碍为特征的阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)和由脑血管疾病所致的血管性痴呆(Vascular Demantia,VD)以及两种类型交织的混合性痴呆(Mixed Dementia,MD)。AD患者最显著的病理表现是大脑组织中存在老年斑(Senile Plaque)和神经纤维缠结(Neurofibrillary Tungles),其中老年斑的核心成分是β淀粉样蛋白,具有极强的神经毒性,是使脑内老年斑周围神经元变性和死亡的主要原因。鉴于拮抗β淀粉样蛋白的专属性药物的研究尚不成熟,故目前临床应用的治疗药物仍以对症为主,包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂、雌激素、抗氧化剂、非甾体抗炎药和羟甲戊二酰还原酶抑制剂(他汀类)等,但这些药物治疗AD的作用机制尚不确切,作用靶位亦不专一,因此导致药物种类繁多,治疗费用不菲,但疗效却有限,因而引发的争论也就在所难免。本文旨在通过回顾AD治疗用药的现状和研究进展,希望文中所提出的问题能引起人们更多的关注和思考,仅供AD药物研发者、?

C4ST-1在大肠杆菌中的可溶性表达

软骨素-4-O-硫酸转移酶-1(Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1,C4ST-1,EC 2.8.2.5)催化软骨素N-乙酰半乳糖胺(N-Acetylgalactosamine,GalNAc)4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)。C4ST-1含3对二硫键,在Escherichia coli细胞质内二硫键难以正确形成,故在E.coli中表达时主要以包涵体形式存在。为提高胞内可溶性蛋白质的表达水平,共表达了催化二硫键从头形成的巯基氧化酶(Erv1p)或/和促进二硫键正确折叠的二硫键异构酶(DsbC)。结果表明共表达DsbC可使C4ST-1融合蛋白的胞内可溶性表达水平显著提高,但C4ST-1和Erv1p共表达对胞内可溶性蛋白质的表达影响相对较小。C4ST-1和Erv1p或C4ST-1和DsbC共表达菌株的酶活分别为原始菌株的1.30和2.33倍,活力达到(12.32±0.76)U/L和(21.99±0.42)U/L。挑取同时共表达C4ST-1、Erv1p和DsbC的菌株进行摇瓶水平和3 L发酵罐放大培养,酶活分别达到(29.12±0.66)U/L和49.97 U/L。本研究为C4ST-1的大规模应用奠定了一定的基础。

基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨半夏泻心汤对慢性萎缩性胃炎大鼠的影响及作用机制

目的:探讨半夏泻心汤通过调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路防治慢性萎缩性胃炎的作用机制。方法:取SD大鼠,除12只正常组大鼠外,其余大鼠联合造模法复制大鼠慢性萎缩性胃炎(CAG)模型,造模成功后随即分为模型组,维酶素组(VG,60 mg·kg^(-1))及半夏泻心汤高、中、低剂量组(280,140,70 mg·kg^(-1)),分别相当于半夏泻心汤生药量28,14,7 g·kg^(-1)。正常组及模型组大鼠给予等体积的蒸馏水,各治疗组给予相应容积的药物灌胃。治疗12周后采用苏木素-伊红(HE)染色法观察CAG大鼠胃黏膜病理变化情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CAG大鼠胃黏膜中Nrf2,醌氧化还原酶-1(NQO1),谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白及mRNA的表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织Nrf2,NQO1,GST蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05),胃黏膜萎缩,甚至肠化。与模型组比较,维酶素组及半夏泻心汤高、中剂量组Nrf2,NQO1,GST蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.05),胃黏膜萎缩、肠化情况明显改善,且以高剂量组改善最为明显,但半夏泻心汤低剂量组作用不明显。结论:半夏泻心汤降低Nrf2的转录活性,关闭Nrf2信号通路,降低NQO1,GST的表达水平,实现正常的氧化-抗氧化平衡可能是其治疗CAG的作用机制之一。