同时测定核苷酸口服液中二磷酸核苷的毛细管区带电泳法

建立了一种毛细管区带电泳法 ,用于同时测定5种核苷酸———鸟苷二磷酸 (GDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺苷二磷酸 (ADP)、胞苷二磷酸 (CDP)、次黄嘌呤核苷酸 (IDP) ;研究了缓冲液的pH值及磷酸盐的浓度对分离5种核苷酸的影响 ,5种核苷酸在75mmol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris) -50mmol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)、pH为8.00的缓冲液中可以基线分离 ;另外还研究了加入阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)以及CTAB的浓度和进样时间对分离5种核苷酸的影响 ;该法成功地应用于测定核苷酸口服液中ADP、CDP、GDP。

一种基于酵母3',5'-二磷酸核苷酸酶的蛋白亲和层析纯化体系

蛋白质是生命活动的主要承担者.蛋白质的结构和功能的研究在后基因组时代尤为重要.为深入分析蛋白质的结构和功能,研究者们需要分离纯化大量不同的蛋白质.亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一.目前,常用的亲和层析标签有多聚组氨酸、谷胱甘肽转硫酶、麦芽糖结合蛋白等,但不同的标签各有其优缺点.例如:研究发现如果表达的蛋白表面有几个接近的组氨酸,此蛋白可能结合Ni-NTA介质,最终和目的蛋白一同洗脱下来,导致多聚组氨酸标签纯化的蛋白纯度不够;麦芽糖结合蛋白标签的缺点为层析介质价格较高且纯化的目的蛋白纯度较低;谷胱甘肽转硫酶标签的缺点为标签蛋白中半胱氨酸的氧化可导致目的蛋白凝集,且此蛋白与其配体的结合较慢,因此,我们需要降低上样流速,延长样品的上样时间等.最近,我们开发了以酵母3',5'-二磷酸核苷酸酶作为原核蛋白表达和分离纯化的标签.本文主要对其蛋白纯化原理和方法进行总结.

3',5'-二磷酸核苷酸酶在亲和双水相胶束系统中分配行为研究

以高分子表面活性剂HM-EO为主成相剂,金属螯合表面活性剂Triton X-114-IDA-Cu(Ⅱ)(TX-Cu(Ⅱ))为辅成相剂,构建新型亲和双水相胶束系统(ATPMS)以提高目标产物的萃取选择性,并考察重组蛋白3',5'-二磷酸核苷酸酶(YND)在系统中分配行为。结果表明,系统中不含亲和配基时YND主要分配于胶束缺失相;随着亲和配基含量的增加,YND与TX-Cu(Ⅱ)亲和结合而逐渐分配到胶束富集相并且在系统中显示出优异的稳定性;调节溶液p H能够影响YND亲和分配,最适萃取条件为pH 9.0;增大无机盐浓度,导致更多杂蛋白分配到胶束缺失相,然而对YND分配影响较小。在2.5%HM-EO、0.125%TX-Cu(Ⅱ)、p H 9.0、50 mmol/L Na Cl条件下,实验获得65.8%的酶活回收率。因此亲和ATPMS可以有效用于对富组氨酸蛋白YND的分离纯化,为该体系在重组蛋白的分离纯化试验提供相应的基础依据。

癌细胞转移抑制基因nm23及其表达产物二磷酸核苷激酶的研究进展

癌细胞转移抑制基因ｎｍ２３及其表达产物二磷酸核苷激酶的研究进展李天洙尹宗柱延边大学医学院肿瘤生物化学研究室关键词肿瘤转移；抑制，遗传；核苷二磷酸激酶类中图法分类号Ｒ７３３７肿瘤转移是引起大多数肿瘤患者死亡的主要因素．癌细胞的转移是一个十分复杂的过程...

脑转移瘤中mtp53、二磷酸核苷激酶/nm23-H_1的表达和临床意义

目的 探讨突变体 p5 3蛋白 (mtp5 3)和二磷酸核苷激酶 (NDPK) /nm2 3 H1在脑转移瘤中的表达和预后关系。方法 采用免疫组织化学卵白素 生物素复合物 (ABC)法检测mtp5 3和NDPK/nm2 3 H1在 31例脑转移瘤中的表达。结果 31例中 19例 (6 1.3% )mtp5 3、4例 (12 .9% )NDPK/nm2 3 H1表达阳性细胞。mtp5 3与NDPK/nm2 3 H1表达呈负相关。mtp5 3阳性、NDPK/nm2 3 H1阴性组生存时间显著短于mtp5 3阴性、NDPK/nm2 3 H1阳性组。结论 mtp5 3和NDPK/nm2 3 H1在脑转移瘤中的表达呈负相关 ,mtp5 3和NDPK/nm2 3 H1可作为判断脑转移瘤预后的客观指标。

二磷酸核苷激酶在膀胱癌中的表达

为了研究ｎｍ２３基因产物与膀胱癌临床病理因素之间的关系，采用免疫组织化学方法检测４７例膀胱癌中ｎｍ２３基因产物二磷酸核苷激酶（ＮＤＰＫ）的表达情况。ｎｍ２３蛋白被定位于胞浆及胞膜，其表达的总阳性率为７２．３４％，阳性率在低分化及浸润性肿瘤中较高（Ｐ＜０．０５）。结果显示ｎｍ２３蛋白表达与膀胱癌分期、分级正相关，提示ｎｍ２３蛋白对于判断膀胱癌的恶性程度可能是一个有价值的标记物。

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因 ,为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序 ,再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA ,并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了 1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY2 2 6980 ) ,全长 5 94bp ,编码 1 5 7个氨基酸 ,编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合 ,成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。

核苷二磷酸激酶A亚基的纯化、鉴定及其对顺铂抗癌作用的增强

目的 了解核苷二磷酸激酶A亚基 (NDPK A)能否提高顺铂的抗癌效果。方法 利用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western印迹杂交来监测和鉴定目标蛋白NDPK A ,利用离子交换、亲和层析结合高效液相色谱纯化分离目标蛋白 ;MTT比色法测定药物对细胞生长抑制率的影响。结果 获得NDPK A单体蛋白 ,酶比活为 8mmol·min- 1·g- 1蛋白质 ;细胞生长抑制率显示 ,NDPK A单独处理细胞时未见明显的细胞毒性 ,但与顺铂联合处理却能大大加强后者对鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep 2的细胞毒性。结论 NDPK A与顺铂联用能增强顺铂对体外培养的鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep

甘蔗核苷二磷酸激酶(NDPK1)基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆了甘蔗核苷二磷酸激酶基因全长cDNA,并用荧光定量PCR分析该基因的表达情况。结果表明:克隆得到的cDNA片段长度为686 bp,包括1个450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,GenBank登录号为JQ712580。甘蔗与高粱NDPK基因cDNA序列的同源性为96%,氨基酸序列同源性为98%;该基因推导的蛋白分子量大小为16.83 ku,等电点为6.58,疏水性分值在-2.089～2.033;蛋白二级结构中α-螺旋占44.3%,随机卷曲占24.83%,延伸链占20.13%,β-转角只占10.74%。实时荧光定量分析结果表明,随着甘蔗干旱胁迫时间的延长,NDPK1基因表达均呈先升高后降低的趋势,30 h达最大;在处理后的18、30、40 h,PEG与PEG+Si处理的NDPK1基因的表达量有显著差异。

核苷二磷酸激酶A的异构及其分子机制

对核苷二磷酸激酶A(NDPKA)的异构及其分子机制进行研究.还原和非还原SDSPAGE观察重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPKA)的异构;RPHPLC分析rhNDPKA异构体的反相色谱行为,并测定rhNDPKA异构体的酶活性;多角度激光散射法测定rhNDPKA异构体在溶液中的表观分子量;飞行质谱分析异构体的质量肽谱.结果发现,rhNDPKA在非还原SDSPAGE上表现为4条带,对应于NDPKA的氧化型、还原型、氧化型二聚体和还原型二聚体,其分子量分别为18.1kD、21.3kD、35.2kD和38.3kD.RPHPLC发现,还原型rhNDPKA和氧化型rhNDPKA疏水性有差异.新鲜制备的rhNDPKA在纯水溶液中,经空气氧化后,逐渐由还原型向氧化型过渡,而还原剂或生理盐水可使rhNDPKA稳定于还原型或氧化型.酶活测定结果表明,还原型rhNDPKA比活性为1965±166Umg,氧化型rhNDPKA比活性为974±53Umg.多角度激光散射检测发现,还原型rhNDPKA在溶液中仍可形成六聚体.质量肽谱结果证明,在氧化型rhNDPKA中,C4和C145位巯基形成二硫键,而C109位巯基游离存在.根据本文所确定的NDPKA单体中的二硫键位置,推导出rhNDPKA单体异构体和二聚体异构体的变构原理,这为进一步研究NDPKA的多能性调节机制打下了良好基础.

植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)研究进展

为了给植物核苷二磷酸激酶NDPKs的进一步研究提供参考,总结了植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)的分类、亚细胞定位、功能及其在植物基因工程中的应用。重点分析了NDPKs功能方面研究的最新进展,NDPKs不仅能够作为一种"看家酶",维持细胞NDP和NTP代谢平衡,而且还是一组多功能蛋白,参与植物细胞的生长与分化、光敏色素A、紫外线-B、热击响应及氧化胁迫响应中的信号传导等多种生命活动过程,甚至具有核酸酶活性。最后指出植物NDPKs的研究方向,并展望了其在植物抗逆基因工程方面良好的应用前景。

重组人核苷二磷酸激酶A的理化性质

对重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK A)进行纯化 ,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚合状态进行鉴定。NDPK A工程菌发酵后的菌体高压匀浆 ,然后微孔过滤、超滤浓缩 ,所得样品经DEAE阴离子交换、CibacronBlue亲和层析、分子筛层析三步纯化后 ,以SDS PAGE和RP HPLC分析纯化产物的纯度 ,RP HPLC测定酶活性。合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定相对分子质量 (MW ) ;Edman降解法测定N末端序列 ;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量。结果表明 ,rhNDPK A纯化产物的SDS PAGE纯度为 97 3% ,RP HPLC纯度为 99 2 % ;比活性为 (90 0± 10 0 )u mg ;单体相对分子质量为 170 17,与NDPK A分子量理论值相差 132。测序结果表明 ,rhNDPK AN末端缺失Met残基 ,其理论分子量为 170 17,与飞行质谱测定结果完全一致。表观分子量测定结果表明 ,rhNDPK A在溶液中形成六聚体 ,表观分子量为 10 2kD。上述结果说明 ,NDPK A重组产物具与天然产物相同的自发形成六聚体性质 ,这为NDPK A新药开发和机理研究打下了良好基础。

用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱

κ-卡拉胶 -魔芋多糖复配胶包埋的啤酒酵母细胞 ,经冻融处理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱 (CDP-胆碱 )。结果表明 :2 5 0 m L摇瓶中加入 5 0 m L反应液 (葡萄糖 40 0 mmol/ L,CMP1 0 mmol/ L,磷酸胆碱 5 0 mmol/ L,K2 HPO4 -KH2 PO4 缓冲液 1 0 0 mmol/ L,Mg SO4 1 0 mmol/ L,p H=8.0 ) ,固定化细胞 1 2 0 0 g/ L,3 4°C、1 5 0 r/ min下 ,反应 4h后补加 40 0 mmol/ L葡萄糖 ,反应 8h可使60 %以上的 CMP转化为 CDP-胆碱。反应液经灭菌和添加辅酶 I(NAD+ )后 ,固定化细胞可连续使用 4次 ,CDP-胆碱转化率维持在 40

有氧运动对线粒体质子跨膜转运及核糖核苷二磷酸还原酶的影响

本实验通过对有氧运动训练 (无负重游泳 6 0分钟 /天 ,7天 )大鼠游泳运动后的骨骼肌、心肌线粒体质子跨膜转运能力及核糖核苷二磷酸还原酶活性的测定 ,发现有氧运动训练的大鼠在定量运动负荷后 (6 0分钟无负重游泳 ) ,骨骼肌线粒体的质子跨膜转运能力显著提高 (P <0 0 5 ) ,以及线粒体的核糖核苷二磷酸还原酶活性明显高于对照组 (未经训练之大鼠 ,P <0 0 0 1)。而心肌线粒体的以上两项指标变化不甚明显。结果显示 ,骨骼肌线粒体对有氧运动训练的适应过程与其质子跨膜转运能力的提高及核糖核苷二磷酸还原酶活性增加有关。提示骨骼肌线粒体在慢性高氧化磷酸化状态刺激下 ,可能同时导致DNA生物合成的增加 ,即线粒体基因组对其功能变化产生应答反应。心肌线粒体的运动适应过程与骨骼肌线粒体不尽相同。

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据GenBank中NDP kinase的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成NDP kinase基因,构建原核表达载体pET28a-NDP kinase并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后NDP kinase基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌BL21(DE3)中该基因经IPTG诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶(NDP kinase)基因的pET28a原核重组质粒,为进一步研究NDP kinase在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌，并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度，以10％比例接种二级种子培养基，在7L发酵罐中培养至OD600为9．6～10．5，然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养，所得菌体裂解后，经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明，50L培养液经过10h培养后，湿菌收量为156％／批，NDPK—A表达量为23．8％。另外，补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比，同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量，但对目的蛋白表达量的提高不明显。在较优条件下，菌体产量为（2220．00±169．71）g／批，蛋白表达量为（22．00±0．42）％，纯化后重组蛋白得率为510mg／L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK—A奠定了基础。

重组人抑癌相关蛋白核苷二磷酸激酶A的原核表达

目的 :为提高表达量 ,简化纯化工艺 ,获得可用于临床研究的重组人NDPK -A蛋白 ,构建带有 6×His纯化标签的原核表达载体 ,优化表达条件获得产物高表达并鉴定产物活性。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒pBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中 ;梯度变化表达条件获得产物高表达 ;镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白 ;Westernblot鉴定产物的免疫原性 ;HPLC测定产物的激酶活性 ;鸡胚尿囊膜试验鉴定产物抑制血管新生的生物活性。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列无误 ;目的蛋白最高表达量可达 4 9 6 % ;纯化的表达产物能与天然NDPK -A的多克隆抗体特异结合 ;酶比活为 4 72U/mg ;具有抑制鸡胚尿囊膜血管新生的活性。结论 :表达质粒pQE -nm2 3H1能高效表达重组人NDPK -A ,纯化工艺简便 ,产物活性与天然NDPK -A无异。

核苷二磷酸激酶A亚基(rhNDPK-A)对体内S_(180)、H_(22)、Lewis及H460肿瘤生长的影响

目的:观察rhNDPK-A对动物移植性肿瘤生长的抑制作用,为临床应用提供科学依据。方法:昆明种健康小鼠85只,每只动物右前肢腋皮下接种传代后8d的S180或H22瘤细胞5×106个,随机分为8组;C57BL/6健康小鼠85只,每只动物右前肢腋皮下接种传代后10d的Lewis瘤细胞2×105个,分组方法同上。给动物接种瘤细胞后24h开始给药。S180和H22模型用尾静脉注射,每日1次,连用8d;Lewis模型用腹腔注射,每日1次,连用10d。Balb/c/neu裸鼠38只,腋窝皮下接种H460瘤组织块1·5mm×1·5mm×1·5mm,当移植瘤体积生长至100mm×100mm×100mm分5组开始腹腔注射给药,每日1次共17次。每周两次测瘤径,计算相对瘤体积,同时称体重。于末次给药后48h处理各组动物,剖瘤称重,计算瘤重抑制率,并进行统计学处理。结果:rhNDPK-A单用,中剂量与高剂量对S180肿瘤生长较明显,抑制率>40%。3个剂量对H22肿瘤生长均具有不同程度的抑制作用,但rhNDPK-A单用,对Lewis肿瘤生长无明显的抑制作用。rhNDPK-A20mg/kg与DDP(0·5mg/kg)合用,对H22肿瘤生长抑制率明显提高。20mg/kgrhNDPK-A对人肺腺癌H460裸鼠移植性肿瘤生长抑制达35·9%。结论:rhNDPK-A对S180、H22、H460肿瘤的生长具有一定的抑制作用,对Lewis肿瘤生长无明显的抑制作用。rhNDPK-A高剂量与DDP合用,对H22肿瘤生长的抑制具有协同作用。

海洋聚磷菌中核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析

以海洋聚磷茵 Halomonas YSR-3的总 DNA 为模板,用 PCR 法扩增核苷二磷酸激酶基因,将扩增片段克隆到 pGM-T 载体,转化 Escherichia coli TOP10菌株,经蓝白斑筛选、菌落 PCR 得到阳性克隆,测序后对序列进行 Blast 比对分析。得到的基因序列长度为420 bp,翻译后的序列与 Loktanella yestfoldensisSKA53,Jannaschia sp.CCS1,Roseobacter sp.CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89%,86%,85%。