RNA干扰抑制二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭的影响

目的观察小干扰RNA（siRNA）抑制二磷酸腺苷（ADP）核糖化因子鸟苷酸激酶1基因（ASAP1）表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法设计合成靶向ASAP1基因的siRNA，采用阳离子脂质体试剂瞬时转染膀胱癌细胞株T24，利用实时定量反转录聚合酶链反应（RT—qPCR）和Western blot检测RNA干扰（RNAi）后ASAP1基因的沉默效果，评价siRNA设计的合理性及RNAi抑制ASAP1表达的有效性，分别在RNAi后1、2、3d应用噻唑蓝（MTY）比色法检测细胞增殖状态，并绘制生长曲线；应用Transwell法检测各实验组膀胱癌细胞的侵袭能力。结果靶向ASAP1的siRNA成功抑制膀胱癌细胞株T24中ASAPlmRNA及蛋白表达，ASAPI—siRNA组mRNA相对表达量为空白对照组的13．5％，蛋白相对表达量为对照组的14．3％；MTT比色法结果显示ASAPI—siRNA组细胞增殖能力显著减弱（P〈0．05），在1、2、3d后重复检测，分别达到了同时间空白对照组的76．3％、59．1％和51．4％；Transwell小室迁移实验结果表明，ASAPl被抑制后，膀胱癌穿膜细胞数明显减少[（49．5±10．4）个比（122．6±14．2）个，P〈0．05]，侵袭能力降低。结论应用siRNA技术能有效抑制ASAP1基因的表达，同时有效抑制T24细胞的体外增殖和侵袭能力。

二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1对甲状腺乳头状癌细胞自噬的调节作用

目的观察二磷酸腺苷(ADP)核糖化因子鸟苷酸激酶1(ASAP1)在调节甲状腺乳头状癌细胞自噬中的作用。方法通过免疫荧光检测郑州大学第一附属医院60例甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中ASAP1以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达水平,分析60例标本中ASAP1的表达水平与患者临床病理特征之间的关系,用慢病毒CRISPR/Cas9技术敲除ASAP1来构建稳定细胞系,通过免疫荧光和蛋白质印迹法(Western blot)检测ASAP1敲除组与对照组之间自噬水平的差异,各变量比较采用χ^2检验和t检验。结果甲状腺乳头状癌组织中ASAP1蛋白平均荧光强度为276.33,癌旁组织中ASAP1蛋白平均荧光强度为74.67,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);甲状腺乳头状癌组织中LC3蛋白平均荧光强度为74.67,癌旁组织中LC3蛋白平均荧光强度为290.67,两组差异有统计学意义(P<0.01);在甲状腺乳头状癌细胞中,ASAP1敲除组LC3Ⅱ蛋白的表达量高于对照组,两组比较差异有统计学意义(MDA-T32细胞:0.463±0.081,P<0.05;MDA-T85细胞:0.750±0.050,P<0.01)。结论ASAP1能够调节甲状腺乳头状癌细胞的自噬,这可能是ASAP1参与甲状腺乳头状癌细胞转移调控的机制之一。

鸟苷酸结合蛋白5和二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1基因在肺结核患者和潜伏结核感染人群中的表达研究

目的探讨鸟苷酸结合蛋白5（GBP5）和二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1（ASAP1）基因在肺结核患者及潜伏结核感染人群中的表达情况。 方法选取2016年8月至2017年5月确诊肺结核患者40例（肺结核组）、潜伏结核感染患者40例（潜伏结核感染组）及健康对照者40例（健康对照组），取入选者外周抗凝血4 ml，应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测这三组人群GBP5、ASAP1基因表达情况。 结果肺结核组、潜伏结核感染组和健康对照组GBP5基因相对表达量分别为1.58 ± 0.80、1.09 ± 0.68和1.04 ± 0.61，差异有统计学意义（F=7.23，P=0.001）；肺结核组GBP5基因相对表达量高于潜伏结核感染组（t=2.93，P=0.004）和健康对照组（t=3.40，P=0.010），差异有统计学意义；潜伏结核感染组GBP5基因相对表达量与健康对照组比较差异无统计学意义（t=0.39，P=0.700）。三组ASAP1基因表达量比较差异无统计学意义（F=0.26，P=0.770）。 结论GBP5基因表达在肺结核患者、潜伏结核感染患者和健康对照者中存在差异，GBP5基因检测可能筛选出潜伏结核感染人群，可作为筛选潜伏结核感染人群的标志物。

知母皂苷A-Ⅲ调控ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴在非小细胞肺癌中的作用机制研究

目的:研究知母皂苷A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ,TAⅢ)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)生长的影响及其作用机制。方法:采用不同浓度TAⅢ(5、10、15、20、25、30μmol/L)处理非小细胞肺癌细胞A549,使用CCK8法检测细胞活力。以定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1-内含子转录因子1(adenosine diphosphate ribosylation factor guanylate kinase 1-intronic transcript 1,ASAP1-IT1)、Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在组织及细胞中的表达。以EDU、流式细胞术和Western blot检测ASAP1-IT1、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta,DNMT3b)、YAP1对细胞增殖情况、细胞凋亡率及其相关基因(Bax和caspase-3)与抗凋亡基因Bcl2的影响。亚硫酸氢盐测序聚合酶链式反应(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分析检测ASAP1-IT1与YAP1的关系。RNA免疫沉淀法(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)和qRT-PCR法检测ASAP1-IT1与DNMT3b之间的相互作用。免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测DNMT3b与YAP1之间的关系。采用qRT-PCR方法检测TAⅢ对ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴相关基因表达的影响。结果:ASAP1-IT1和YAP1在NSCLC组织和A549细胞中表达上调,而DNMT3b表达下调,加入TAⅢ可逆转这些效应。沉默ASAP1-IT1和YAP1、过表达DNMT3b或应用TAⅢ可增加A549细胞凋亡率和细胞凋亡相关指数。TAⅢ有逆转沉默或过表达ASAP1-IT1、DNMT3b和YAP1的作用。最后发现ASAP1-IT1与DNMT3b相互作用,而DNMT3b与YAP1相互作用。结论:ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴通过调节细胞增殖和凋亡促进NSCLC进展。TAⅢ通过调节ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴抑制肺癌细胞增殖,促进其凋亡。