猪二磷酸腺苷-核糖基化因子6的克隆与原核表达

为了探索二磷酸腺苷-核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的关系及ARF6在PRRSV感染过程中的调控作用,本试验克隆猪arf6基因和构建PGEX-4T-arf6融合蛋白质原核表达载体。结果显示:arf6包含一个长度为528bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码175个氨基酸,理论分子质量为20 080,pI为8.97。结构特征分析显示,猪ARF6蛋白质含有典型的p loop、switch区、interswitch区和N端疏水区的Hasp,在N端第二位含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸。arf6分布没有组织特异性。经过表达和纯化的ARF6-GST融合蛋白质可作为制备抗血清的抗原。

二磷酸腺苷核糖基化因子6和centaurin-α1与突触重塑

肌动蛋白细胞骨架的重塑是神经元发育和突触重塑的重要环节。二磷酸腺苷核糖基化因子(ARFs)是参与驱动的三磷酸鸟苷酶(GTPases)家族之一,其中对二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)研究相对较多,其和鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)及GTP酶活化蛋白(GAPs)在神经元发育,包括树突、树突棘和轴突的生长中有重要作用。本文复习了ARF6及其相关因素在神经系统中的作用。

二磷酸腺苷核糖基化因子6与肿瘤侵袭和迁移关系的研究进展

临床上对于肿瘤侵袭和转移缺乏有效的治疗手段,导致了肿瘤疾病的高死亡率。研究显示超过90%肿瘤相关死亡是由肿瘤侵袭和转移引起[1]。肿瘤细胞实现远处侵袭和转移,必须具有降解细胞外基质、侵袭和迁移的运动能力。因此,研究肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的调控机制,将为研究转移性肿瘤治疗新策略提供实验依据和理论基础。

多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1通过激活NF-κB途径导致高糖人视网膜血管内皮细胞凋亡

目的探讨多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[poly(adenosine diphosphate-ribose)polymeras-1,PARP-1]和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在高糖人视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)中的相互作用及其在人RVEC中的表达定位及作用机制。方法体外培养人RVEC及HEK293T细胞,并进行传代,同时构建高糖人RVEC细胞模型。构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,酶切鉴定后转染高糖培养的人RVEC,Western blot法检测重组质粒表达目的基因的效果,并应用Western blot法和免疫共沉淀法检测高糖人RVEC中PARP-1和NF-κB的相互作用。PARP-EGFP和Flag-NF-κB质粒共转染人RVEC,激光共聚焦扫描显微镜检测PARP-1和NF-κB在高糖人RVEC中的定位及其相互作用。结果人RVEC复苏后24 h贴壁,细胞呈扁平梭形,3 d左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象。成功构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,并有效表达目的基因。免疫共沉淀结果显示PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,高糖组NF-κB p50的条带比正常对照组明显增粗,并且高糖情况下PARP-1结合NF-κB的量较正常对照组明显增加。激光共聚焦扫描显微镜结果显示PARP和NF-κB均表达于正常的人RVEC的细胞核和核周区域,当受到高浓度葡萄糖影响后,PARP-1和NF-κB均集中表达于细胞核内,尤以NF-κB最显著。结论 PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,血糖增高时,PARP-1可能进入细胞核内并结合同时进入细胞核的NF-κB,激活NF-κB信号通路,引起RVEC凋亡,导致DR的发生。

二磷酸腺苷核糖基化因子6对甲状腺乳头状癌细胞增殖和转移的影响

目的探讨二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)对甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP增殖和转移的影响及相关机制。方法在B-CPAP细胞中构建ARF6沉默细胞系及瞬时转染外源3×Flag-ARF6;利用EdU、CCK-8实验检测ARF6对B-CPAP细胞增殖的影响;利用Transwell实验检测ARF6对B-CPAP细胞转移的影响;利用蛋白质印迹法(Westernblotting)检测沉默及过表达ARF6对细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响。结果与对照组相比,沉默ARF6后B-CPAP细胞的增殖、侵袭和迁移的能力明显下降[ARF6沉默组及其对照组EdU阳性细胞的比例分别为(33.75±1.50)%和(39.65±2.21)%,第5天OD值分别为(0.66±0.03)和(0.83±0.03),细胞侵袭数量分别为(614.66±18.52)和(898.34±38.94)个,细胞迁移数量分别为(588.67±18.02)和(922.32±34.91)个,均P<0.05]。与对照组相比,过表达ARF6后B-CPAP细胞的增殖、侵袭和迁移的能力明显提升[ARF6过表达组及其对照组EdU阳性细胞的比例分别为(46.53±4.09)%和(36.89±2.27)%,第5天OD值分别为(1.06±0.03)和(0.81±0.02),细胞侵袭数量分别为(943.68±24.69)和(758.42±10.78)个,细胞迁移数量分别为(974.68±23.68)和(726.32±27.04)个,均P<0.05]。沉默ARF6可上调B-CPAP细胞中p-ERK1/2和MMP-9的表达、下调E-cadherin的表达,过表达ARF6时则相反,均P<0.05。结论ARF6可能通过调控p-ERK1/2、MMP-9及E-cadherin的蛋白表达,从而促进甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP的增殖和转移。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和凋亡诱导因子在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠亚细胞器中的表达

目的研究聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)和凋亡诱导因子(AIF)在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑皮质细胞线粒体、胞质、胞核中的动态变化,探讨PARP-1诱导AIF核转位的机制和AIF在HIBD中的作用。方法新生7dSD大鼠随机分为2组:假手术组和缺氧缺血(HI)组。每组按观测时间点的不同分为3h、6h、12h、24h、3d、7d6个亚组,每个亚组8只。在每个时间点将大鼠断头取皮质脑组织匀浆,行亚细胞器分离,用Westernblot方法测不同时间点亚细胞器中AIF、PARP-1的动态变化。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法染色法检测相应时间点光镜下脑皮质组织的凋亡细胞数。结果 1.HI后AIF在脑皮质亚细胞器中的表达变化:假手术组各个时间点的线粒体内均有AIF表达,且无量的变化,在胞质内有少量表达,而在胞核内无表达;HI组线粒体内AIF3h开始增加,6h达到高峰后下降,7d时基本降至正常,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);AIF到胞质和胞核转位从HI后3h开始增加,24h胞质、胞核内均达到高峰,随后下降,到7d时仍高于假手术组(P<0.05)。2.PARP-1仅在各组胞核中有少量表达,但在胞质、线粒体内无表达。3.HI后3h结扎侧脑皮质开始有少量的凋亡细胞增加,24h达高峰,随后下降。结论 AIF在HIBD新生大鼠线粒体、胞质、胞核内均是增加的,胞质、胞核内表达高峰滞后于线粒体;AIF在其胞质、胞核内转位趋势与脑皮质凋亡细胞数变化在时间上一致;PARP-1不能转位到线粒体内直接诱导AIF的核转位。

SIRT3抑制PARP-1活性缓解多巴胺能神经元炎症损伤

目的研究多巴胺能神经元SIRT3表达对小胶质细胞活化所致其炎症损伤的抵抗作用及相关机制。方法建立多巴胺能神经元MN9D细胞与小胶质细胞BV-2共培养体外炎症损伤模型。将MN9D细胞分为对照组、模型组、SIRT3组、SIRT3+PJ34(PARP-1抑制剂)组。实时定量聚合酶链式反应分析mRNA水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1法检测线粒体膜电位变化,酯化钙黄绿素与氯化钴共孵育法分析线粒体通透性转运孔(mPTP)开放情况,Western blot检测蛋白表达情况。结果与模型组比较,SIRT3过表达则使SIRT3组MN9D细胞的凋亡率明显降低,SIRT3和SOD_(2)基因表达明显增多,PARP-1、TNF-α及IL-1β蛋白表达明显减少,p-NF-κB p65/NF-κB p65比值明显变小,线粒体膜电位上升,mPTP开放和ROS生成减少,组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);SIRT3+PJ34组MN9D细胞PARP-1活性抑制后,除SIRT3和IL-1β蛋白表达变化不明显外,其它考察指标的变化趋势在SIRT3组基础上进一步增大,两组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论SIRT3表达能够缓解小胶质细胞激活所致多巴胺能神经元的炎症损伤,机制可能与其改善线粒体功能,减少ROS生成抑制PARP-1活性及NF-κB信号通路有关。

miR-509通过调控二磷酸腺苷-核糖基化因子6对人舌鳞状细胞癌SCC15细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-509对人舌鳞状细胞癌SCC15细胞生物学行为的影响及对二磷酸腺苷-核糖基化因子6(adenosine diphosphate-ribosylation factor 6, ARF6)信号通路的调控作用。方法取对数生长期SCC15细胞,随机分为miR-509 mimic组(转染miR-509 mimic)、miR-509 inhibitor组(转染miR-509 inhibitor)、mimic NC组(转染mimic NC)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC)、对照组(仅转染脂质体)。转染24 h, 5组采用实时荧光定量PCR法检测miR-509相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用Transwell小室试验检测细胞侵袭能力,采用Western blot法检测ARF6蛋白相对表达量。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-509与ARF6的靶向关系。结果 miR-509 mimic组miR-509相对表达量(6.17±0.25)、细胞凋亡率[(12.46±0.37)%]均高于对照组[4.28±0.36、(3.08±0.30)%]和mimic NC组[4.25±0.34、(2.98±0.41)%](P<0.05),侵袭细胞数[(8.82±2.07)个]少于对照组[(27.40±3.26)个]和mimic NC组[(28.36±3.14)个](P<0.05),ARF6蛋白相对表达量(0.27±0.05)低于对照组(0.62±0.05)和mimic NC组(0.64±0.04)(P<0.05);miR-509 inhibitor组miR-509相对表达量(2.50±0.28)、细胞凋亡率[(2.16±0.45)%]均低于对照组和inhibitor NC组[4.26±0.33、(3.06±0.24)%](P<0.05),侵袭细胞数[(125.26±3.36)个]多于对照组和inhibitor NC组[(28.93±2.85)个](P<0.05),ARF6蛋白相对表达量(0.86±0.06)高于对照组和inhibitor NC组(0.68±0.06)(P<0.05);miR-509 inhibitor组miR-509相对表达量、细胞凋亡率均低于miR-509 mimic组(P<0.05),侵袭细胞数多于miR-509 mimic组(P<0.05),ARF6蛋白相对表达量高于miR-509 mimic组(P<0.05);对照组、mimic NC组和inhibitor NC组miR-509相对表达量、细胞凋亡率、侵袭细胞数、ARF6蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。ARF6 WT+miR-509 mimic组荧光素酶活性(0.52±0.17)低于ARF6 WT+mimic NC组(1.55±0.22)(t=6.417,P<0.001);ARF6 MUT+miR-509 mimic组荧光素酶活性(1.53±0.26)与ARF6 MUT+mimic NC组(1.56±0.25)比较差异无统计学意义(t=0.144,P=0.892)。结论 miR-509上调可促进人舌鳞状细胞癌SCC15细胞凋亡、抑制其侵袭,可能通过靶向抑制ARF6蛋白表达发挥作用。

乙型肝炎病毒X蛋白下调微RNA-544-3p并激活Arf6/Akt-mTOR信号轴促进肝脏细胞迁移和侵袭

目的探讨mi RNA-544-3p对乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)诱导的肝细胞癌的影响及分子机制。方法培养含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx的慢病毒稳转小鼠永生化肝前体细胞株14-19(HBx-EGFP-14-19细胞),并通过向昆明小鼠肝门静脉注射上述细胞构建可长期稳定表达HBx的模型,采用q PCR检测mi RNA-544-3p在HBxEGFP-14-19细胞及小鼠模型肝组织中的表达。在HBx-EGFP-14-19细胞中瞬时转染mi RNA-544-3p模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor),应用划痕愈合实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测mi RNA-544-3p对HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭的影响,采用q PCR和蛋白质印迹法探究mi RNA-544-3p对二磷酸腺苷核糖基化因子6(Arf6)、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)表达的调控作用。结果成功构建了可长期稳定表达HBx的小鼠模型,该小鼠在造模后360 d处死时可见肝组织有恶性肿瘤生成。与对照组相比,HBx-EGFP-14-19细胞和HBx模型小鼠各时间点(造模后30、90、180、360 d)肝组织中mi RNA-544-3p表达水平均降低(P均<0.05)。与对照组比较,转染mi RNA-544-3p mimic的HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均降低,转染mi RNA-544-3p inhibitor的HBxEGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均增强(P均<0.05)。q PCR和蛋白质印迹法检测结果显示mi RNA-544-3p低表达与Arf6表达水平上调、Akt-m TOR信号轴的激活有关。结论HBx可能通过下调mi RNA-544-3p激活Arf6/AktmTOR信号轴促进小鼠肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

单唾液酸四己糖神经节苷脂对大鼠脑出血后PAPR-1/AIF通路的影响

目的研究单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)对大鼠脑出血后神经功能障碍的作用及可能机制。方法通过自体血注入法建立大鼠尾状核脑出血模型,采用两种不同剂量(15 mg/kg、30 mg/kg)GMI进行干预,并将大鼠随机分为4组:假手术组,脑出血组,小剂量组,大剂量组。观察脑出血后大鼠神经功能评分,细胞凋亡情况,并采用Western印迹法检测各组脑组织多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1、凋亡诱导因子(AIF)、Bcl-2及Bax的表达量情况。结果脑出血后除假手术组外其余各组均出现不同程度的神经功能障碍,治疗组神经功能障碍轻于脑出血组,且大剂量组优于小剂量组(P<0.05);大鼠在脑出血后均出现细胞凋亡现象,治疗组细胞凋亡程度明显低于脑出血组,且存在量效关系(P<0.05);蛋白质印迹法检测结果显示:大鼠脑出血后均出现PARP-1、AIF表达上调,Bax/Bcl-2比值明显上升,经单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗后PARP-1、AIF表达明显下调,而Bax/Bcl-2比值下降,且大剂量组变化程度大于小剂量组(P<0.05)。结论GMI在大鼠脑出血后的治疗中可能通过对PARP-1/AIF通路的调节,减轻脑出血后细胞凋亡程度,从而达到脑保护作用。

干扰Arf6抑制人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭

目的观察干扰二磷酸腺苷核糖基化因子6(Arf6)对人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭的影响,并初步探讨其调控机制。方法脂质体转染法将靶向Arf6的特异性siRNA序列、无效序列转染至DU145细胞,分别设为干扰组和NC组,不做处理为空白组。蛋白免疫印迹(Western blot)检测siRNA干扰效率;MTT法检测细胞增殖;划痕试验及Transwell试验检测细胞迁移及侵袭;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot检测Arf6、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)mRNA及蛋白表达、磷酸化MEK(pMEK)、pERK蛋白表达。结果靶向Arf6的特异性siRNA序列干扰活性为62.67%±4.38%。干扰组不同时刻细胞增殖均显著低于空白组和NC组(P<0.05);干扰组细胞迁移率、穿膜细胞数均显著低于空白组及NC组(P<0.05);干扰组Arf6、Rac1 mRNA及蛋白相对表达量、pMEK/MEK、pERK/ERK蛋白比值显著低于空白组及NC组(P<0.05)。结论干扰Arf6可抑制人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭能力,可能与下调pMEK、pERK、Rac1蛋白表达,抑制MEK/ERK信号通路有关。

PARP-1抑制剂通过激活SIRT1-PGC-1α轴减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的炎症和氧化应激反应

目的:通过构建慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠实验模型,探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂是否通过调控沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)减轻COPD大鼠的炎症和氧化应激反应,探究SIRT1-PGC-1α轴作为PARP-1抑制剂作用新靶点的可能性。方法:将48只SD大鼠随机选取12只作为健康组,剩余大鼠构建COPD实验模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、PARP-1抑制剂处理组、PARP-1抑制剂+PGC-1α抑制剂组,HE染色观察肺组织病理形态变化,ELISA检测大鼠肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,荧光定量PCR法检测各组大鼠SIRT1、PGC-1αmRNA表达水平,Western blot检测SIRT1、PGC-1α蛋白表达。结果:健康组大鼠肺组织结构完整,与健康组相比,模型组大鼠肺组织产生结构损伤,有大量炎症细胞浸润,肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高,血清中MDA含量显著升高,SOD含量显著降低,SIRT1、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著降低;与模型组相比,PARP-1抑制剂处理组大鼠肺组织结构恢复,炎症细胞减少,TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低,血清中MDA含量显著降低,SOD含量显著升高,SIRT1、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著升高;与PARP-1抑制剂处理组相比,PARP-1抑制剂+PGC-1α抑制剂组炎症细胞数量增加,TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高,血清中MDA含量显著升高,SOD含量显著降低,SIRT1、PGC-1αmRNA及蛋白表达显著降低。结论:PARP-1抑制剂可通过激活SIRT1-PGC-1α轴,缓解炎症和氧化应激反应,从而有效缓解COPD。

慢病毒稳定下调ADP核糖基化因子的GTP酶激活蛋白1表达对肺腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨慢病毒稳定下调腺苷二磷酸核糖基化因子的三磷酸鸟苷酶激活蛋白1(ASAP1)表达对肺腺癌细胞增殖和侵袭的影响。方法收集郑州大学第一附属医院病理科2022年8月1日至2023年5月1日手术切除肺腺癌及配对癌旁组织各5例,免疫组织化学(IHC)检测ASAP1在人肺腺癌组织中的表达,结合在线数据库(KM-plotter、HPA、UALCAN)分析ASAP1表达与肺腺癌患者预后的关系。在体外用ASAP1阴性对照慢病毒(NC)和ASAP1敲低短发夹RNA慢病毒(ASAP1 KD)感染A549和HCC4006细胞,构建稳定下调ASAP1表达的肺腺癌细胞系。蛋白印迹(WB)检测ASAP1蛋白下调效率,通过平板克隆实验、细胞活力检测试剂盒(CCK-8)、迁移实验、Transwell侵袭实验、蛋白印迹检测下调ASAP1对细胞增殖侵袭的影响和对上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达的影响,两组间比较采用独立样本t检验。结果ASAP1在人肺腺癌组织中的表达远高于癌旁正常组织(209.70±9.02比48.33±2.89,t=29.51,P<0.01),且多个数据库显示ASAP1的表达与患者不良预后明显相关[KM-plotter数据库(P<0.0001)、HPA数据库(P<0.001)、UALCAN数据库(P<0.01)];体外实验结果显示,较NC组,ASAP1 KD组的ASAP1蛋白表达明显下调(A549细胞株:0.99±0.03比0.36±0.01,t=27.39,P<0.01;HCC40006细胞株:1.02±0.07比0.27±0.07,t=11.08,P<0.01),细胞形成的克隆数量明显减少(A549细胞株:233.70±5.51比33.67±10.02,t=69.28,P<0.01;HCC4006细胞株:333.3±30.55比50.33±5.508,t=14.17,P<0.01),细胞在450nm波长处的吸光度值降低(A549细胞株:1.18±0.06比0.64±0.11,t=8.20,P<0.05;HCC4006细胞株:0.94±0.04比0.57±0.09,t=4.79,P<0.05)。此外,ASAP1 KD组穿过小室成功迁移的细胞数量明显减少(A549细胞株:137.00±8.54比19.67±5.03,t=32.00,P<0.01;HCC4006细胞株:42.67±3.51比12.33±2.51,t=45.50,P<0.01),穿过基质胶成功侵袭的细胞数量明显减少A549细胞株:207.70±9.07比(41.33±4.73,t=49.17,P<0.01;HCC4006细胞株:35.00±5.00比6.67±1.53,t=9.39,P<0.01);ASAP1 KD组EMT相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达升高(A549细胞株:0.45±0.2比0.82±0.06,t=10.58,P<0.01;HCC4006细胞株:0.42±0.06比0.78±0.07,t=6.59,P<0.01);N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达降低(A549细胞株:0.79±0.05比0.39±0.03,t=11.67,P<0.01;HCC4006细胞株:0.72±0.06比0.25±0.02,t=11.91,P<0.01);波形蛋白(Vimentin)表达降低(A549细胞株:0.69±0.02比0.36±0.01,t=24.56,P<0.01;HCC4006细胞株:0.79±0.03比0.48±0.02,t=13.25,P<0.01)。结论ASAP1在肺腺癌中高表达并与患者不良预后相关,下调ASAP1表达可抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭。

circARF3下调miR-195减轻TNF-α诱导的ATDC5软骨细胞炎症损伤

为探讨环状RNA(circular RNA,circRNA)ADP核糖基化因子3(ADP ribosylation factor 3,ARF3)调节miR-195对TNF-α诱导的ATDC5软骨细胞炎症损伤的影响,将ATDC5细胞分为对照组(control,Cont)、TNF-α组、pCMV-BC组、pCMV-ARF3-NC组、pCMV-ARF3组、inhibitor-NC组、miR-195a inhibitor组、miR-195b inhibitor组、pCMV-ARF3+mimics-NC组、pCMV-ARF3+miR-195a mimics组和pCMV-ARF3+miR-195b mimics组。qRT-PCR检测各组ATDC5细胞中ARF3的mRNA及miR-195a/b相对表达量;FACS检测ATDC5细胞的凋亡水平;ELISA检测细胞培养上清液中细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、IL-1β、IL-6和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)水平;RNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验验证circARF3与miR-195a、miR-195b的结合情况;Western blotting检测Ⅱ型胶原(collagenⅡ,COL2)、蛋白聚糖Aggrecan、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)、MMP1、剪切caspase 3(cleaved caspase 3,cl-caspase-3)和cl-caspase-9蛋白表达量。结果显示,与Cont组相比,TNF-α组ATDC5细胞ARF3 mRNA、COL2和Aggrecan蛋白表达量显著降低(均P<0.05),而miR-195a、miR-195b相对表达量、cl-caspase-3、cl-caspase-9、MMP13和MMP1蛋白表达量、ATDC5细胞凋亡率及上清液中COX-2、IL-6、IL-1β和ICAM-1水平显著升高(均P<0.05)。过表达ARF3或低表达miR-195a、miR-195b可抑制ATDC5细胞凋亡、炎性因子释放及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解。circARF3可结合并靶向下调miR-195a和miR-195b表达。过表达miR-195a或miR-195b可部分逆转高表达ARF3对ATDC5细胞凋亡、炎症应答和ECM降解的抑制效应。由此,circARF3或作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)吸附miR-195a和miR-195b,过表达ARF3可通过下调miR-195a和miR-195b表达抑制TNF-α诱导的ATDC5细胞凋亡、炎症应答和ECM降解。

连豆清脉方对SD大鼠动脉粥样硬化形成的预防作用及NF-κB信号通路的影响

目的研究连豆清脉方对大鼠动脉粥样硬化(AS)形成的预防作用,以及对核因子-κB(NF-κB)炎症信号通路中Toll样受体-4(TLR-4)、NF-κB、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)的影响。方法 50只大鼠随机分为基础组10只、空白预防组(空预组)10只、模型组10只、辛伐他汀预防组(辛预组)10只、连豆清脉方预防组(连预组)10只;后4组大鼠通过高脂饲料喂养建立早期AS模型,同步采用连豆清脉方、辛伐他汀,分别对大鼠AS模型进行预防性干预。并对主动脉血管壁厚度、组织PARP-1阳性细胞表达率、外周血单个核细胞TLR-4 m RNA表达、血清NF-κB水平检测计算。结果 1)光镜下大鼠主动脉血管壁厚度存在差异(P<0.01),连预组和辛预组大鼠主动脉血管壁厚度明显薄于模型组(P<0.01),但是和空预组比较差异无统计学意义。免疫组化染色光镜下大鼠左心室组织PARP-1表达具有显著差异,PARP-1阳性细胞表达率存在统计学差异(P<0.01),连预组和辛预组PARP-1阳性细胞表达率明显低于模型组(P<0.01),但是明显高于空预组(P<0.01),具有统计学差异。2)大鼠外周血单个核细胞TLR-4 m RNA表达各组间存在统计学差异(P<0.01),连预组和辛预组TLR-4 m RNA表达明显低于模型组(P<0.01),且连预组低于空预组(P<0.05)。大鼠血清NF-κB水平各组间存在差异(P=0.001);其中连预组NF-κB水平明显低于模型组(P<0.01),但与空预组比较差异无统计学意义。结论连豆清脉方可预防高脂饮食导致的AS形成;其机制与抑制NF-κB炎症信号通路PARP-1、TLR-4、NF-κB等环节有关。

3-氨基苯甲酰胺抑制糖尿病大鼠晶状体混浊的实验研究

目的:探讨PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对糖尿病大鼠晶状体混浊程度的影响及其可能机制。方法:Wistar大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、3-AB干预组。糖尿病组和3-AB干预组大鼠予以腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,正常对照组注射等体积柠檬酸盐缓冲液。建模成功后3-AB组每日按照30mg/kg给予3-AB灌胃,正常对照组和糖尿病组则给予等体积9g/L生理盐水(NS)灌胃。观察并记录各组大鼠晶状体混浊进展情况,分别于给药后2,4,8wk处死各组大鼠,取出晶状体检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)和糖基化终末产物(AGE)的含量,并检测晶状体上皮细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达情况。结果:灌胃3wk时糖尿病组和3-AB组大鼠均开始出现不同程度的晶状体混浊,4wk和8wk时糖尿病组晶状体混浊程度比3-AB组重(P<0.01)。3-AB组大鼠晶状体中GSH-Px和SOD活性在2,4,8wk时均高于糖尿病组(均P<0.05),但均低于正常对照组(P<0.01)。3-AB组大鼠晶状体中MDA的含量在2,4,8wk时均低于糖尿病组(P<0.05),但均高于正常对照组(P<0.01)。糖尿病组和3-AB组大鼠晶状体中AGE含量在2,4,8wk时高于正常对照组(均P<0.05),而糖尿病组在2wk和4wk时高于3-AB组(P<0.05),但在8wk时无差异。MMP-2在正常对照组大鼠晶状体上皮细胞几乎无表达,在2,4,8wk时糖尿病组均强于3-AB组(P<0.05)。bFGF在三组大鼠晶状体上皮细胞均呈阳性表达;在2,4,8wk时,糖尿病组和3-AB组均强于正常对照组(均P<0.05),但糖尿病组与3-AB组之间无差异。结论:3-AB对STZ诱导的糖尿病大鼠晶状体混浊具有一定抑制作用,其机制可能是通过减轻STZ诱导的糖尿病大鼠晶状体上皮细胞氧化损伤,降低非酶糖基化水平,抑制晶状体上皮细胞中MMP-2的表达,减轻晶状体上皮细胞外基质降解,从而抑制晶状体混浊。

尼克酰胺对糖尿病大鼠肾脏核转录因子影响

目的了解实验性糖尿病大鼠肾组织中核转录因子-kappa B(NF-κB)表达与肾功能损害关系,观察尼克酰胺对NF-κB的影响。方法45只Wistar大鼠中随机选取30只进行糖尿病造模,造模成功24只,随机分为糖尿病组和糖尿病尼克酰胺处理组(干预组),各12只,从未造模15只大鼠中随机选取12只作为对照组。收集糖尿病大鼠24 h尿样,测定尿白蛋白排泄率(UAE);采用电泳迁移率变动分析技术检测肾组织NF-κB活性;透射电镜检测肾小球基底膜厚度及系膜基质密度;免疫组织化学染色法观察尼克酰胺对糖尿病大鼠肾脏NF-κB表达的影响,分析NF-κB表达与肾小球内粘附分子(ICAM-1)蛋白表达、单核细胞浸润及肾脏功能和结构损害的关系。结果糖尿病大鼠中,肾小球NF-κB表达较正常肾组织增高(P<0.01),NF-κB阳性细胞数(9.18±2.42)与肾小球ICAM-1蛋白表达(0.3973±0.0312)、单核细胞浸润(8.14±3.43)显著相关,相关系数(r)值分别为0.57(P<0.05)和0.68(P<0.01)。用尼克酰胺干预后,肾组织NF-κB表达和肾小球基底膜厚度(337.1±67.9 nm)及系膜基质密度(39.58±6.21)μm2/μm2明显下降(P<0.01),肾功能各指标及肾组织病理学损害改善。结论尼克酰胺对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与抑制NF-κB活化,下调受NF-κB调控的ICAM-1表达、减轻单核细胞浸润有关。

不同周龄大鼠血管硬化程度与NF-κB炎症信号通路的关系

目的探讨不同周龄大鼠血管硬化程度与核因子(NF)-κB炎症信号通路的关系。方法8周龄清洁级雄性SD大鼠30只,普通饲料喂养。分别在第9、13、21周龄随机抽取大鼠10只,并对主动脉壁厚度和心肌组织多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1阳性细胞数、心肌组织Toll样受体(TLR)-4 mRNA、外周血TLR-4 mRNA、组织和血清NF-κB水平、组织和血清中白细胞介素(IL)-6及IL-10、血脂胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平进行检测。结果大鼠主动脉壁厚度和PARP-1阳性细胞数随着大鼠周龄增加而增加(均P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB、血清IL-6水平随着大鼠周龄增加而增加(P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB水平、血清IL-6水平均和大鼠周龄呈正相关(均P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB、血清IL-6水平随着大鼠周龄增加而增加(P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB水平、血清IL-6水平均和大鼠周龄呈正相关(均P<0.05)。大鼠TC、LDL-C水平随着大鼠周龄增加而增加(P<0.05)。大鼠血脂TC、LDL-C水平和大鼠周龄呈正相关(均P<0.05)。结论大鼠年龄增长和动脉粥样硬化及NF-κB炎症信号通路具有相关性。

3-氨基苯甲酰胺影响糖尿病大鼠晶状体上皮细胞NF-κB表达的免疫组化研究

目的观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对早期糖尿病(DM)大鼠模型晶状体上皮细胞中核因子κB(NF-κB)表达的影响。方法采用一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg建立DM大鼠模型。成模后将大鼠随机分为正常对照组(N组)、糖尿病组(DM组)和干预组(DM+P组)。自建立模型后第3天起,DM+P组每日给予3-AB 30 mg/kg灌胃,N组和DM组每天给予等体积0.9%生理盐水灌胃。分别于给药后2、4、8周处死各组大鼠,取出晶状体,免疫组化SP法检测晶状体上皮细胞中NF-κB P65的表达情况。结果 DM 2、4、8周组大鼠晶状体上皮细胞NF-κB P65表达较相应时间点的N组高;DM+P 2、4、8周组大鼠晶状体上皮细胞NF-κB P65表达较相应时间点的N组高;DM+P 2、4、8周组与相应时间点DM组比较,晶状体上皮细胞NF-κB P65表达降低。结论 PARP抑制剂3-AB可以抑制早期糖尿病大鼠晶状体上皮细胞中NF-κB的表达。

GLP-1类似物利拉鲁肽对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经PARP-1/NF-κB表达的影响

目的:通过构建大鼠糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)模型探究胰高血糖素样肽1(glucagonlike peptide 1,GLP-1)类似物利拉鲁肽对DPN大鼠坐骨神经聚腺苷二磷酸核糖聚合酶/激活核因子-κB(poly ADP-ribose polymerase/nuclear factor kappa-B,PARP/NF-κB)表达的影响。方法:SD大鼠84只,随机选12只作为正常组;其余大鼠均采用链脲佐菌素诱导建立DPN模型。建模成功后,抽取72只大鼠随机分为模型组,胰岛素组,甲钴胺组,利拉鲁肽低、中、高剂量组。正常组和模型组皮下注射等体积生理盐水,胰岛素组给予胰岛素治疗,甲钴胺组给予甲钴胺治疗,给药组给予不同剂量利拉鲁肽治疗,共治疗8周。记录各组大鼠体质量和血糖,测定神经反应速度,ELISA检测炎症因子,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测PARP-1、NF-κB蛋白表达,EMSA检测NF-κB转录活性。选择RSC96细胞建立高糖环境下细胞损伤模型,应用基因芯片预测PARP-靶基因,并通过转染PARP-1进行检验。结果:与模型组比较,利拉鲁肽治疗后大鼠体质量显著增加,血糖显著降低,神经反应速度提高(P<0.05);大鼠实验和细胞实验显示利拉鲁肽给药后细胞炎症因子含量及PARP和NF-κB蛋白表达较模型组显著降低,高剂量组降低幅度更明显(P<0.05);大鼠神经细胞凋亡率较模型组显著降低(P<0.05);利拉鲁肽抑制了NF-κB的转录活性;PARP-1转染组炎症因子和PARP-1、NF-κB蛋白水平显著高于中剂量组(P<0.05),PARP-1/NF-κB是GLP-1对糖尿病神经病变大鼠抗炎症作用的重要靶点。结论:利拉鲁肽可以降低DPN大鼠坐骨神经PARP-1和NF-κB的表达水平,从而降低大鼠坐骨神经损伤,起到防治糖尿病周围神经病变损伤的作用。