鲨鱼硫酸软骨素二糖组成分析及其4S/6S比值的讨论

目的研究鲨鱼来源硫酸软骨素的二糖组成,并对鲨鱼硫酸软骨素(shark-CS)4S/6S(N-乙酰半乳糖胺上4-硫酸化基团/N-乙酰半乳糖胺上6-硫酸化基团)比值进行探讨。方法通过酶解液相色谱法及文献比较对鲨鱼来源的硫酸软骨素二糖组成进行分析。结果鲨鱼硫酸软骨素主要由6-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-6S)、4-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-4S)、2,6-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-2,6diS)以及无硫酸化的软骨素二糖(ΔDi-0S)组成,其百分含量分别为28%~65%、10%~44%、9%~25%、0.5%~23%。Shark-CS 4S/6S比值不超过0.8。结论提出Shark-CS 4S/6S比值的正确计算方法,解决了数据相互矛盾的问题。指出USP43中关于shark-CSΔDi-6S峰面积百分比大于ΔDi-4S峰面积百分比的不合理规定,为USP43修订提供参考与依据。

大鼠肾脏糖胺聚糖的种类及二糖组成分析

采用两步酶解和离子交换色谱从Wistar大鼠肾脏中提取糖胺聚糖,以醋酸纤维素薄膜电泳分析糖胺聚糖种类,以弱阴离子交换色谱分离各种糖胺聚糖。纯化后的糖胺聚糖分别经特定糖胺聚糖酶裂解,采用强阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)紫外检测分析其二糖组成。结果表明,Wistar大鼠肾脏糖胺聚糖主要由硫酸乙酰肝素和少量硫酸皮肤素组成。硫酸乙酰肝素含有8种二糖,其中含有乙酰基二糖总含量高达77.6%,非硫酸化二糖(Ⅳ-A)含量为59.7%;硫酸皮肤素含有6种二糖,其中单硫酸化二糖总含量为54.8%,非硫酸化二糖含量为32.9%。

猪肝组织中硫酸乙酰肝素的分离纯化及二糖组成分析

目的从少量猪肝组织中分离纯化硫酸乙酰肝素(HS)并进行二糖组成分析。方法分别采用胰蛋白酶及中性蛋白酶对猪肝组织进行酶解,再分别采用AG 50W-X2强阳离子交换色谱、Sephadex G-10凝胶过滤色谱、Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换色谱法纯化。将纯化的HS分别采用肝素酶Ⅰ和Ⅲ降解,所得到的二糖经2-氨基苯甲酰胺标记后,采用PA03色谱柱分析其二糖组成。结果经色谱和电泳分析,所得到的HS不含蛋白质及其它糖胺聚糖,其二糖组成以非硫酸化和低硫酸化二糖为主。结论该方法可以有效分离、纯化猪肝组织中的HS,并适用于少量组织中HS二糖组成分析。

伊拉兔肺中硫酸软骨素C的分离纯化及二糖组成分析

目的:从伊拉兔肺中提取分离硫酸软骨素C(chondroitin sulfate C,CSC),并对其进行二糖组成分析。方法:采用丙酮、氯仿-甲醇(2∶1)对兔肺进行脱脂,利用木瓜蛋白酶对脱脂粉进行酶解。提取的粗品经75%乙醇沉淀,氯代十六烷基吡啶(CPC)将其中的酸性多糖富集获得总糖胺聚糖TFH。采用Q-Sepharose Fast Flow树脂对TFH分级纯化获得TF-C。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生反相HPLC法分析单糖组成,利用硫酸软骨素酶ABC降解,SAX-HPLC法分析二糖组成。结果:所得TF-C不含蛋白质,主要由葡萄糖醛酸(Glc A)和氨基半乳糖(Gal N)组成,二糖组成以不饱和△UA-Gal NAc6S为主,含有少量的△UA-GalNAc4S。结论:首次从伊拉兔肺中分离获得低硫酸化高纯度CSC,为伊拉兔肺高值化产品的开发和利用提供了理论依据。

安康鱼鱼骨糖胺聚糖的提取及组成分析

目的提取安康鱼鱼骨中的糖胺聚糖并分析其二糖组成。方法以碱解-酶解法提取安康鱼头骨中的糖胺聚糖,检测提取物中总糖醛酸、总氮、总硫含量,并进行红外检测及高效液相色谱(HPLC)分析。结果提取物总硫含量与硫酸软骨素差别较大,红外图谱中指纹区域与硫酸软骨素标准图谱不符,酶解液相图谱与硫酸软骨素不同。结论该提取物并非硫酸软骨素,而是一种非硫酸化的糖胺聚糖。

色谱技术在肝素结构分析中的研究进展

肝素(heparin,Hp)是目前临床应用最为广泛的抗凝剂,是由重复二糖单元组成的多硫酸化酸性直链多糖。低分子量肝素(LMWHs)是以肝素为原料,经过化学或酶降解获得的相对分子质量相对较小的肝素衍生物,相对肝素,它们的出血副作用和免疫原性更小,皮下注射时生物利用度更高。肝素及低分子量肝素具有一系列结构特点,如相对分子质量偏大且有一定分布,多种糖残基同时存在,硫酸酯位置和数量呈现多样化,以及不同工艺产生的特殊残基的种类和含量不一等。该类药物结构的复杂性对分析方法提出了巨大的挑战,也限制了其质量控制提升、工艺优化、临床用药安全和新适应证拓展等。该文以色谱分析方法为中心,从结构分析的不同角度,包括单糖、二糖、寡糖、多糖的识别、组成分析和不同层次,系统地梳理和阐述近年来肝素类药物在色谱分析方法上的进展,并对这些方法的应用范畴、创新性、局限性等进行总结。该文将为肝素类药物的结构分析、质量控制提供较系统的方法学参考,为更多新方法开发提供思路,为更深入地研究肝素类药物结构、拓展其应用提供有力支撑。

一种鉴别粗品肝素钠不同种属来源的简便方法

目的采用SAX-HPLC快速鉴别不同种属来源的粗品肝素钠。方法通过肝素酶酶解不同种属来源的粗品肝素钠,以其酶解后的二糖组份为考察对象,通过SAX HPLC法比较二糖的相对组成,鉴定种属来源。同时在猪来源肝素中分别添加不同比例(5%,10%,15%,20%,25%)的牛来源肝素或羊来源肝素,经肝素酶酶解后,通过SAX HPLC法鉴别在猪来源肝素中是否能快速检出不同种属来源的其他肝素。结果对于不同种属来源的粗品肝素钠,它们的二糖组成具有显著差异;若猪来源肝素混入5%羊来源肝素,即可通过其二糖组成判断。结论此法操作简便,成本较低,可用于不同种属来源的粗品肝素钠的定性检测。

猪脑来源糖胺聚糖的分离纯化及精细组成分析

目的:从猪脑中提取分离糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs),并进行精细结构分析。方法:猪脑组织经脱脂、蛋白酶酶解后,经氯代十六烷基吡啶(CPC)富集,乙醇沉淀获得糖胺聚糖粗品。利用Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱纯化,获得7个组分(P1～P7)。所得分级样品分别经肝素裂解酶与硫酸软骨素裂解酶酶解,2-氨基吖啶酮(AMAC)荧光标记后,利用液质联用方法分析其精细结构。结果:猪脑GAGs粗品中主要获得硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)和少量透明质酸(hyaluronic acid,HA),含量分别为307,293和18 mg·kg^(-1)。P2～P4组分GAGs含量较少; P5～P7组分CS和HS含量相当,CS中以ΔUA-GalNAc4S为主; HS组成以ΔUA-GlcNAc为主,电荷密度略低,未获得肝素组分。结论:基于液质联用技术分析猪脑组织的精细结构,为动物来源糖胺聚糖的研究提供依据。

鼠肝硫酸乙酰肝素生化结构的试验分析

目的评估一种硫酸乙酰肝素的生化学分析方法,并对小鼠肝脏硫酸乙酰肝素的二糖组成及分子量进行生化分析。方法充分利用硫酸乙酰肝素的物理化学特点,进行提取及纯化。用酶降解及2-AB标记后,行高效液相色谱分析。所得色谱与二糖标准色谱比较得出样品的二糖组成,与分子量色谱比较得出样品的分子量。结果纯化提取的小鼠肝脏糖胺聚糖经肝素酶消化后,可获得相近的二糖含量及二糖组成。0S二糖,含量最高为(7.01±0.81)pmol/mg干重,占二糖总量的58.27%,其次为NS二糖,含量为(3.47±0.99)pmol/mg,占28.27%,再次依次为6S二糖[(0.85±0.99)pmol/mg,6.87%],Tris二糖[(0.50±0.33)pml/mg,3.85%],S1二糖(0.21pmol/mg,1.65%)和S2二糖(0.14pmol/mg,1.1%)。硫酸乙酰肝素二糖总量为(12.17±2.44)pmol/mg。硫酸乙酰肝素的分子量大小约为28kD。结论采用该文提取纯化方法的硫酸乙酰肝素纯度高,得出的小鼠肝脏硫酸乙酰肝素二糖组成及分子量可信度高,适于用来分析各种肝脏疾病时硫酸乙酰肝素的生化改变。

金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响

分别在不含Cu^(2+)、Fe^(3+)和含有不同量Cu^(2+)、Fe^(3+)的条件下对肝素钠进行氧化,通过测定肝素钠的分子量及分子量分布、效价、二糖组成的变化,考察了金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响.结果表明,Cu^(2+)、Fe^(3+)会使肝素钠的部分糖苷键断裂,导致分子量降低、分子量分布发生变化、低分子量的糖片段占比增加;同时使得肝素钠的效价及效价回收率降低;体系中Cu^(2+)、Fe^(3+)含量越多,对肝素钠的破坏作用越强,分子量及效价下降越明显,且相同含量下Cu^(2+)的破坏作用强于Fe^(3+);体系中Cu^(2+)、Fe^(3+)含量越多,肝素钠二糖ΔⅣA的相对含量整体越高,主要二糖ΔⅠS的相对含量则越低.金属元素Cu、Fe的存在会对肝素钠质量产生影响,在肝素钠生产过程中应对Cu^(2+)、Fe^(3+)进行风险控制,必要时应增加Cu^(2+)、Fe^(3+)的去除工艺,以保证肝素钠产品质量.

3种鱼鳃中糖胺聚糖的分离纯化及细微结构比较分析

目的从狭鳕（Alaska pollack）、褐牙鲆（Bastard halibut）和真鲷（Red seabream）3种鱼鳃中提取分离糖胺聚糖并对其细微结构进行比较分析。方法利用酶法降解并以阴离子交换色谱法分离纯化糖胺聚糖,通过单糖组成和醋酸纤维素薄膜电泳对其种类进行鉴别,采用高效液相色谱法对其相对分子量和二糖组成进行比较分析,最后利用核磁共振波谱法（1 H-NMR）对其结构进行表征。结果从3种鱼鳃组织中提取分离得到54种多糖组分,其中18种是电荷和分子量均一的糖胺聚糖,它们集中在0.8mol·L-1 NaCl洗脱部分（P4）和1.0mol·L-1 NaCl洗脱部分（P5）,占多糖总量的17.4%～58.4%;P4主要为硫酸软骨素C（CSC）,P5主要为硫酸软骨素A（CSA）和杂合硫酸软骨素（HyCS）,尤其,与牛气管来源CSA比较,HyCS的4S/6S比和电荷密度均较大。结论狭鳕、褐牙鲆和真鲷鱼鳃组织中的糖胺聚糖主要为CSA、CSC和HyCS。

平颏海蛇皮中新型硫酸皮肤素的分离纯化和结构表征

目的从平颏海蛇皮中提取分离糖胺聚糖(GAGs),并对其结构进行初步表征。方法对海蛇皮进行脱脂处理后,采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶联合酶解提取粗多糖,采用氯代十六烷基吡啶(CPC)沉淀和Q-Sepharose Fast Flow离子交换树脂对粗多糖进行分离纯化。运用醋酸纤维素薄膜电泳分析其GAGs种类,采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生高效液相色谱(HPLC)法分析其单糖组成,利用硫酸软骨素酶降解结合质谱和强阴离子交换色谱(SAX-HPLC)法分析其二糖组成。结果获得了2种GAGs纯化组分,并对其中1种含量较高的纯化组分(HSAP-2)进行了初步结构表征。HSAP-2中含有4种二糖,主要为单硫酸化二糖(4S和6S);单糖组成中含有艾杜糖醛酸(IdoA)、葡萄糖醛酸(GlcA)和乙酰氨基半乳糖(GalNAc);是1种高度杂合的新型硫酸皮肤素(DS)。结论从平颏海蛇皮中分离纯化获得了1种结构新颖的DS,为平颏海蛇多糖结构与生物活性的深入研究提供了基础。