不同pH对蛋清溶菌酶形成淀粉样纤维的影响

试验旨在研究不同pH对淀粉样纤维形成的影响。以蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme,HEWL)为模型蛋白,在不同pH的甘氨酸(50 mmol/L)溶液中(57.0±0.1)℃孵育0~8 d,使其形成不同聚集程度的淀粉样纤维,pH设为2.0、6.5、7.5和8.0;用透射电镜定性观察淀粉样纤维生成状况,采用硫磺素T(ThT)荧光法和刚果红染色法测定淀粉样纤维生长状况,8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)荧光法测定淀粉样纤维疏水性变化,圆二色谱法测定二级结构转化,BeStSel软件预测β-折叠含量。结果显示,透射电镜下观察第8天纤维生长状况发现,pH为2.0时HEWL形成了大量的短杆状淀粉样纤维,同时ThT荧光法结果表明淀粉样纤维生长状况最好(P<0.01),且生长趋势呈时间依赖性;刚果红染色法显示,在490~510 nm出现红移、540 nm出现特征性肩峰,疏水性显著增强,并且二级结构转化明显,β-折叠含量从天然HEWL蛋白的6.1%增加到37.6%;pH 6.5组仅在透射电镜下观察到极少量的淀粉样纤维,pH 7.5组在视野中未观察到明显的淀粉样纤维,仅观察到大量的球状或杆状蛋白聚集体;pH 8.0组未产生淀粉样纤维。高温条件下,HEWL在强酸性(pH 2.0)条件较易形成淀粉样纤维,且此时疏水性和二级结构转化程度最高,这为解释朊病毒病及其他淀粉样变性疾病的淀粉样纤维形成机制提供了理论基础。