原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性

【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明,ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为D-Phe外,其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数kcat/Km表示,对于底物D-Met或D-Phe,ApDAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上。【结论】ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值。