二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用

随着科学技术的迅猛发展,现代生物学技术已经发展到后基因组时代,蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。二维差异凝胶电泳(Two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术是在双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术,是分析和鉴定基因功能的强有力工具,比经典的2-DE技术具有更高的动力学范围和灵敏性。该文就2D-DIGE技术的发展以及在昆虫研究上的应用前景进行了展望。

结直肠癌组织的二维荧光差异凝胶电泳分析

目的以二维荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)技术分析结直肠癌(CRC)组织及正常结直肠组织的蛋白质表达差异。建立二者间的蛋白质表达差异图谱。方法6对样品分别取自6例CRC手术切除的新鲜的癌和正常肠黏膜组织,进行2-D DIGE,TyphoonTM多功能扫描仪进行图像扫描,并以DeCyderTM2-D差异分析软件分析。结果正常肠黏膜组织和癌组织有统计学差异(P<0.05)的表达蛋白点共有315个,癌组织中表达上调(>1.5倍)的有138个,下调(>1.5倍)的有103个。结论建立了CRC与正常肠黏膜组织的2-D DIGE图谱,发现并经统计学证实癌组织中有表达上调或下调的蛋白存在。

肝癌细胞蛋白差异凝胶电泳技术系统评估方法

利用二维差异凝胶电泳技术(two-d im ensional d ifferential in-gel electrophoresis,2D-D IGE)研究肝癌细胞与正常细胞的差异时应先对其蛋白样品进行标记系统评估,以确保正式实验的成功。在细胞水平上展开蛋白质组研究应尽可能提取到细胞的所有蛋白,为此本研究先比较了机械刮除法、胰酶消化法和PBSE消化法收获肝癌细胞后的细胞形态与蛋白得率,结果显示PBSE消化法收集肝癌细胞时细胞形态完整,提取的蛋白得率最高。然后将提取的细胞蛋白经D IGETM试剂盒的3重荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向电泳(2DE,two-d im ensional electrophoresis)。前者图像使用Im ageQuant软件进行分析,结果说明肝癌细胞蛋白提取液与该染料能相互兼容,样品得到了有效的标记。2DE的扫描图像使用DeCyder 5.0软件的胶内分析(d ifferential in-gel analysis,D IA)和胶间分析(b iological variation analysis,BVA)模式,结果表明,Cy3和Cy5标记的蛋白质定量结果基本一致,但该染料标记肝癌细胞蛋白后会造成极少量蛋白出现位置偏差,给蛋白定量带来一定的误差影响,而BVA中的反标策略能够有效纠正这种由于不同荧光标记带来的定量误差。总之,本研究首次报道了用同一肝癌样品进行不同荧光标记后进行2DE的评估方法,该方法支持了D IGE体系定量的可靠性,而且能给出定量的误差范围,完善了评估体系,为D IGE技术平台的质量控制提供了参考。

体外模拟脑缺血再灌注OGD/R模型的差异凝胶电泳分析

目的:通过体外模拟缺血-再灌注损伤(I/R)诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型的建立,应用蛋白质组学技术观察凋亡细胞蛋白质组的差异表达,进一步揭示神经元凋亡的发生机制。方法:选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予OGD10h/R24h处理建立OGD/R诱导SH-SY5Y细胞凋亡模型,提取对照组和实验组细胞总蛋白,利用荧光染色双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)检测细胞蛋白质组的差异表达变化。结果:DeCyder软件分析2D-DIGE凝胶图像显示平均分离了(1 800±156)个蛋白质点;与对照组比较,实验组共有30个蛋白点的表达水平有显著变化(蛋白表达量上调或下调30%以上),其中22个升高,8个降低,与同时间对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:应用双向差异凝胶电泳的蛋白质组学技术在OGD/R模型中发现有差异蛋白的表达。

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。

冠心病血瘀证血小板差异功能蛋白筛选、鉴定及功能分析

目的寻找冠心病血瘀证患者冠脉事件关键血小板功能蛋白。方法纳入冠心病血瘀证组患者,设立正常对照组,每组分4个小组,即两组各有4次重复。抽取外周血,分离血小板并提取蛋白,将各个提取血小板蛋白样本按小组等体积混合、定量。用荧光差异显示二维凝胶电泳技术筛选、基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱技术鉴定血小板差异功能蛋白。对鉴定成功差异蛋白,用Western-blotting进一步验证。结果筛选出13个差异蛋白点,质谱成功鉴定7个:isoform 1 of integrinalpha-Ⅱb、isoform 2 of integrinalpha-Ⅱb、actin-cytoplasmic1、actin-cytoplasmic 2、cDNAFLJ52842、cDNAFLJ55253、cDNAFLJ43573fis。其中isoform2ofintegrinalpha-Ⅱb(CD41)和actin-cytoplasmic2(Actinγ)成功验证。结论 CD41和Actinγ是冠心病血瘀证的标志蛋白。其他血小板功能蛋白的异常表达可能在冠心病血瘀证事件发生发展中起关键作用。

宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织差异表达蛋白分析

目的探讨蛋白质组学方法筛查正常宫颈与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织中的差异表达蛋白质标志物,为研究CIN发生的分子机制及临床诊治工作提供依据。方法收集2008年8月至2009年9月间首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科收治的正常子宫颈组织因子宫肌瘤手术行全子宫切除术患者9例为对照组、CIN组织23例(其中CINⅠ7例、CINⅡ8例、CINⅢ8例)。应用二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2-DDIGE)及DeCyder软件寻找差异表达蛋白质点,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析差异蛋白质点,数据库搜索鉴定差异表达最明显的S100蛋白家族A9(S100 calcium-binding protein A9,S100A9),真核延长因子1α1(eukaryoticelongation factor 1-alpha-1,eEF1A1)及丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)3种蛋白质;应用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)(其中正常宫颈组织10例、CINⅠ10例、CINⅡ10例、CINⅢ10例)及蛋白印记法(Western blotting)(其中正常宫颈组织12例,CINⅠ～Ⅱ12例,CINⅢ12例)进一步验证上述3种蛋白在CIN组织和正常宫颈组织的表达差异。结果获得CIN组织与正常宫颈组织2-D DIGE图,成功鉴定25个蛋白;免疫组化及蛋白印迹验证结果提示:S100A9蛋白表达于细胞质中,在CIN中表达水平高于正常组,差异有统计学意义(P=0.010);eEF1A1蛋白表达于细胞质中、PKM2蛋白表达于细胞核中,2者在CIN中表达水平均低于正常组,差异有统计学意义(P分别为0.352,0.000)。结论在正常宫颈组织与CIN组织之间存在差异蛋白质表达,S100A9蛋白可能成为辅助诊断CIN的相关标志物,PKM2蛋白可能成为抑制CIN发生的蛋白质,并可根据2种差异蛋白表达预测CIN的发生发展。

拟南芥响应3-羰基己酰基高丝氨酸内酯的膜蛋白质组分析

为了探索植物响应细菌信号N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的分子机制。本文利用二维差异凝胶电泳技术分析了3-羰基己酰基高丝氨酸内酯(3OC6-HSL)处理引起拟南芥膜蛋白质组的变化情况,结果表明3OC6-HSL共诱导53个蛋白点发生显著变化,涉及天然免疫、逆境胁迫响应、碳代谢、能量代谢、光合作用等多种生物学功能,暗示了3OC6-HSL在调控植物生长发育和抗逆性方面发挥着重要作用,可为阐明植物-细菌跨界通讯的分子机制提供更多的功能蛋白质信息。

中波紫外线与化学致癌物诱导下HaCaT细胞的蛋白表达应答

对角质形成细胞HaCaT分别进行中波紫外线(UVB)照射、2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)刺激及UVB+DNBS(UD)共同刺激,利用二维荧光差异胶内凝胶电泳(2D DIGE)、DeCyder定量分析软件和HPLC-nESI-MS/MS分析技术,对HaCaT细胞产生的差异表达蛋白进行了鉴定.有65个蛋白质点发生了明显表达差异(P<0.05),与UVB或DNBS单独处理细胞相比,有41个蛋白点表现为UVB和DNBS的正协同效应,13个蛋白点表现为负协同效应,5个蛋白点与UVB单独处理相近,6个蛋白点与DNBS单独处理相近.HPLC-nESI-MS/MS从65个差异表达蛋白质点中共鉴定出60种单一(Unique)蛋白.采用生物信息学方法对这些鉴定蛋白所涉及的分子功能、参与的生物学过程及信号通路进行了系统分析.实验得到了与紫外辐射和化学诱导损伤的直接相关蛋白,有助于研究不同环境条件下皮肤癌的形成及皮肤疾病的有效防护与治疗.

利用蛋白质组学筛选肾透明细胞癌肿瘤标志物

目的:通过蛋白质组学筛选和验证肾透明细胞癌中潜在肿瘤标志物。方法:采用比较蛋白质组学方法筛选正常肾组织和肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)组织中的差异表达蛋白,通过二维差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(Q-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry,FT-ICR MS)分离并鉴定16例RCC组织及其相应的正常组织中差异显著的蛋白,并进一步通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、Western印迹和免疫组织化学在RNA和蛋白水平进行验证。结果:通过2D-DIGE共筛选出1 873个蛋白质点,选取68个表达差异大于1.5倍的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出51个蛋白质(P<0.05),其中16个蛋白表达上调,35个表达下调。采用qRT-PCR和Western印迹验证16例肿瘤和对照组织,结果表明在肿瘤组织中NNMT和Annexin IV表达显著升高,而ACY1和Calbindin显著下调(P<0.01)。同时针对ACY1和Annexin IV蛋白分别在53例和47例样本中进行免疫组织化学,结果显示相较于对照组织,ACY1在肾透明细胞癌中表达显著降低(P<0.001),而Annexin IV显著升高(P<0.001)。结论:ACY1和Annexin IV可作为肾透明细胞癌的肿瘤标志物。

人胃腺癌原发灶与转移灶中差异蛋白表达谱的初步研究

目的 利用二维差异凝胶电泳（DIGE）技术建立分辨率高和重复性好的人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,并分析差异表达蛋白质.方法 收集、筛选6例新鲜的人胃腺癌原发灶组织及转移的淋巴结组织标本进行比较蛋白质组学研究.用非染色冰冻切片显微切割法分别获取人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中的腺癌细胞,裂解后提取蛋白,每例取等量蛋白,任选3例混合,共分成2组.用DIGE染料Cy2、Cy3、Cy5对样品分别标记,然后进行双向电泳,获得人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,最后使用Typhoon扫描仪进行图像扫描,用DeCyder-Differential分析软件进行分析,识别两者之间的差异表达蛋白质.结果 应用非染色冰冻切片显微切割法得到较纯的原发灶与淋巴结转移灶中的癌细胞,不会因为染色问题改变蛋白所带电荷引起的2-DE图像模式的改变,提示它是一种低价、简便的样品制备方法之一.对6例胃癌原发灶与淋巴结转移灶的腺癌细胞样本进行二维差异凝胶电泳,建立了分辨率高、重复性好的差异表达图谱.分析显示差异凝胶1、差异凝胶2的蛋白质点分别为1 416个（相似点1 062个,下调点277个,上调点77个）、1 299个（相似点1 050个,下调点157个,上调点92个）.运用DeCyder-Differential软件（Biological Variation Analysis version 5.0）对Gel1、Gel2中的蛋白质点进行分析（P=0.05,阈值：＞1.5倍或者＜-1.5倍）,获得11个差异表达的蛋白质.结论 非染色冰冻切片显微切割法及DIGE技术是一种简单可行的蛋白质样品纯化方法,建立了分辨率高、重复性好的人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,为进一步探讨胃癌转移机制、特异性标志物筛选奠定了初步基础。

正常宫颈宫颈上皮内瘤变与宫颈鳞癌组织的差异表达蛋白分析

目的探讨采用比较蛋白质组学方法筛查正常宫颈、宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈鳞癌（SCC）组织中的差异表达蛋白，为研究CIN发展为SCC的分子机制及临床诊治工作提供依据。方法收集正常宫颈组织（因子宫肌瘤行全子宫切除术）9例、CIN组织23例（其中CINI级7例、CINII级8例、CINIII级8例）和SCC组织7例。应用二维荧光差异凝胶电泳和DeCyder软件寻找差异表达蛋白质点，基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪鉴定差异蛋白质点，数据库搜索差异表达蛋白。收集正常宫颈组织20例、CIN组织60例和SCC组织20例，应用免疫组化法和Westernblot法验证差异最显著的S100蛋白A9（S100A9）、真核翻译延长因子1α1（eEF1A1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）在不同宫颈组织中的表达差异。结果建立了分辨率高、重复性好的正常宫颈、CIN与SCC的双向凝胶电泳图谱。选取显著表达差异蛋白质点46个（其中上调27个，下调19个）进行鉴定，成功鉴定出26个蛋白质。免疫组化法检测结果显示，S100A9蛋白主要表达于细胞质，其在正常宫颈组织、CIN组织和SCC组织中的阳性表达率分别为20．0％、70．0％和100．0％，差异有统计学意义（P=0．006）。eEF1A1蛋白主要表达于细胞质，其在正常宫颈组织、CIN组织和SCC组织中的阳性表达率分别为70．0％、73．3％和60．0％，差异无统计学意义（P=0．758）。PKM2蛋白主要表达于细胞核，其在正常宫颈组织、CIN组织和SCC组织中的阳性表达率分别为100．0％、93．3％和75．0％，差异接近有统计学意义（P=0．059）。Westernblot法检测的结果与免疫组化法检测的结果基本一致。结论正常宫颈、CIN和SCC组织间存在蛋白质表达的差异。S100A9、eEF1A1和PKM2可能成为宫颈癌早期诊断的标志物和治疗的新靶点，并为研究CIN发展为宫颈癌的发病机制提供基础。

钙结合蛋白在前列腺癌中的下调表达及其临床意义

目的探讨钙结合蛋白（CAB39）在前列腺癌中的作用及其临床意义。方法应用蛋白组学二维荧光差异凝胶电泳（2D—DIGE）技术筛选出在局限性前列腺癌与癌旁组织差异性表达的CAB39蛋白，质谱分析（MS）鉴定、免疫组织化学技术检测CAB39蛋白在24例前列腺癌与癌旁组织中的表达，结合CAB39免疫组织化学评分和前列腺癌患者的临床病理参数进行分析。结果CAB39蛋白在癌旁组织中的免疫组织化学染色阳性率高于前列腺癌组织（70．8％比33．3％，P〈0．01），CAB39蛋白表达在前列腺癌患者年龄、血清前列腺特异抗原（PSA）水平、Gleason评分和肿瘤TNM分期各不同分组中的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论CAB39蛋白在前列腺癌患者中下调表达，它可能是前列腺癌抑制因子。

谷胱甘肽硫基转移酶μ-3在前列腺癌中的表达及意义

目的：探讨谷胱甘肽硫基转移酶μ-3（ glutathione S-transferase mu 3，GSTM3）在前列腺癌中的表达及意义。方法2012年9月至2013年9月应用二维荧光差异凝胶电泳技术筛选前列腺癌标本中的差异蛋白，并利用质谱分析验证前期表达谱基因芯片结果获得的GSTM3。选取28例行根治性前列腺切除术患者的病理标本。患者年龄＜60岁22例，≥60岁6例；PSA 水平＜4μg/L 5例，≥4μg/L 23例；Gleason评分＜7分26例，≥7分2例；TNM分期＜T2a期18例，≥T2a期10例。采用实时荧光定量PCR法检测前列腺癌组织及其癌旁组织中GSTM3的表达情况，分析GSTM3与患者临床病理参数的相关性。结果二维荧光差异凝胶电泳获得前列腺癌与癌旁组织的双向凝胶电泳图谱，结果显示GSTM3为差异表达的蛋白，GSTM3蛋白在前列腺癌组织中表达下调，与癌旁组织比较差异有统计学意义（ P＜0．05）。实时荧光定量PCR法检测结果显示，GSTM3在癌旁组织中的表达（8．12±0．51）显著高于癌组织（7．18±0．54），差异有统计学意义（P＜0．05）。 GSTM3的表达与患者的年龄、PSA水平、Gleason评分、TNM分期均无显著相关性（P＞0．05），在不同PSA水平分组中GSTM3表达差异无统计学意义（P＞0．05）。结论与癌旁组织比较，GSTM3在前列腺癌组织中表达下调，但GSTM3的表达与前列腺癌的恶性程度无关。