非聚丙烯酰胺凝胶电泳(Non-PAGE)的复杂蛋白质组表达分析:一种新的二维液相技术用于完整蛋白质的高通量分离分析

揭示基因组-转录子组-蛋白质组(Genome-transcriptome-proteome)的关系、描绘蛋白质翻译后修饰(PTM)的途径、常规地运用质谱(MS)技术进行蛋白质的定性和识别,这三方面的力量和需求将推动日后的新药开发.在过去的几年里,蛋白质定性和蛋白质组学研究的突飞猛进有赖于这三方面发展的相结合,这种整合成为生物技术研发(R&D)工作流程的一个典范.正如人类基因组计划的经验,研究生物相关体系中的复杂蛋白的表达同样亟待新的分析技术和手段.

运用二维液相色谱-质谱联用技术快速测定伊沙佐米合成过程中微量杂质

目的:建立一种运用二维液相色谱-质谱联用技术快速测定伊沙佐米合成过程中微量杂质的新方法。方法:一维体系中,使用质谱不兼容流动相0.1%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B)对伊沙佐米与杂质进行正常分离,二维体系中使用质谱兼容流动相0.5%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)连接高分辨质谱对杂质进行质荷比的检测。通过软件控制阀切换,使一维体系中的目标杂质峰切入二维体系中,根据测定的分子离子峰及二级碎片质荷比,结合合成工艺,进行杂质初步推断。结果:液相分离出的杂质结合质谱精确分子量,参考伊沙佐米可能的断裂机制,解析了杂质结构。并在实验室进行了定向合成,通过液相色谱分析,进一步佐证了鉴定杂质结果的准确性。结论:建立的二维液相色谱-质谱联用新方法,可快速实现伊沙佐米合成过程中微量杂质的定性分析,为伊沙佐米的合成工艺优化与质量控制提供参考。

基于纳升级二维液相色谱技术的过敏性哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达

目的研究过敏性哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达。方法将24只Wistar大鼠随机分为空白对照组、捆绑组和哮喘模型组,应用纳升级二维液查色谱技术研究哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达。结果哮喘模型组血清多肽谱峰与捆绑组比较,新出现特异性峰1个,为13号峰(94.731 min);特异性消失的峰3个,为1号峰(77.489 min)、2号峰(78.418 min)和5号峰(80.533 min),可能与哮喘发病有关;捆绑组血清多肽谱峰与空白对照组比较,新出现特异性峰4个,为2号峰(78.418 min)、4号峰(79.398 min)、5号峰(80.533 min)和7号峰(81.824 min),特异性峰消失1个,可能与捆绑应激刺激有关。结论过敏性哮喘的发病机制与蛋白异常表达密切相关,但动物实验需要注意区分应激因素导致的相关蛋白表达干扰。

二维超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术鉴定氯化琥珀胆碱原料药中的杂质

目的:建立鉴定氯化琥珀胆碱原料药中杂质的方法。方法:采用二维超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术。一维色谱柱为Hypersil GOLD C_(18),以缓冲液(含22 mmol/L戊烷磺酸钠+50 mmol/L氯化钠+5 mmol/L硫酸)为流动相A,以乙腈为流动相B,流动相A、B的体积比为95∶5,柱温为40℃,流速为1.0 m L/min,检测波长为214 nm;二维色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C_(18),以0.1%氨水为流动相A,以乙腈为流动相B,采用梯度洗脱,柱温为30℃,流速为0.4 m L/min;离子化模式为ESI+,毛细管电压为2.5 k V,离子源温度为120℃,雾化气温度为450℃,雾化气流速为900 L/h,采集模式为MSE。结果:通过一维液相色谱在氯化琥珀胆碱原料药中检出琥珀酸、琥珀酰氯(工艺中间体)及吡啶(试剂)等杂质;另有4个比较明显的未知杂质,分别命名为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4,其中尤以杂质2的表观含量最高。通过二维液相色谱质谱联用法推断杂质2为脱氢琥珀酰单胆碱,杂质4为氯化琥珀酰单胆碱,杂质1、杂质3在质谱中均未被检测到信号。结论:本研究建立了鉴定氯化琥珀胆碱原料药中杂质的方法,其研究结果可用于评价氯化琥珀胆碱原料药的质量。

二维液相色谱技术在药物分析中的应用

二维液相色谱联用(2D一LC)技术作为一项新的分析技术,其具有峰容量大、显著降低复杂样品的基质效应和残留现象及可以实现样品分析的自动化等特点,已在复杂样品的分离分析中发挥了巨大作用。所以,本文对二维液相色谱原理做了简单的介绍,并重点对其在生物样品药物分析中的应用进行了阐述。

大鼠股神经肌支和隐神经损伤前后差异蛋白分析

目的研究股神经肌支和隐神经纤维损伤7 d后二者蛋白表达的差异。方法成年雌性SD大鼠20只,体质量220~250 g。将大鼠右侧股神经干横断,左侧作为对照组不作处理。7 d后分别对正常股神经肌支及隐神经、损伤股神经肌支及隐神经取材,运用同位素标记相对和绝对定量技术标记(114标记正常的股神经肌支;115标记损伤的股神经肌支;116标记正常的隐神经;117标记损伤的隐神经)并结合二维液相色谱-串联质谱技术进行差异蛋白分析。结果共鉴定出3 358个蛋白。其中损伤的股神经肌支与正常的股神经肌支相比差异蛋白293个,表达升高112个,表达降低181个;损伤的隐神经神经与正常的隐神经相比差异蛋白417个,表达升高184个,表达降低233个。结论成功筛选出大鼠股神经运动神经纤维与感觉神经纤维损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供基础数据。

Vinculin在大肠癌及肾癌中的表达及意义

目的测定vinculin在大肠癌及肾癌组织中的表达情况,探究其在大肠癌及肾癌发生发展中的意义。方法用二维液相色谱-质谱联用技术对20例DukesB期大肠癌患者的癌组织及癌旁组织、18例透明细胞肾癌患者的癌组织及癌旁组织中vinculin表达水平进行检测,并通过免疫印迹实验进一步验证。结果 vinculin在大肠癌组织中的表达水平低于其癌旁组织,相反,在肾癌组织中表达较其癌旁组织高。结论 vinculin在大肠癌及肾癌的发生发展中起一定作用。

大鼠感觉、运动神经瓦勒氏变性前后蛋白分析

目的通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术联合二维液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术研究感觉、运动神经损伤7 d后蛋白表达差异。方法成年雄性Wistar大鼠40只,体质量220~250 g,随机分为对照组和实验组,各20只。实验组大鼠脊髓横断,对照组不作处理。7 d后对两组大鼠脊神经前后根神经取材,运用iTRAQ技术标记(114标记正常运动神经;115标记损伤的运动神经;116标记正常的感觉神经;117标记代表损伤的感觉神经)并结合2D LC-MS/MS技术进行差异蛋白分析,并利用基因本体论和京都基因与基因组百科全书信号通路分析差异蛋白所在信号通路。结果共鉴定出4 312个蛋白:1)其中运动神经损伤后差异蛋白数量为637个,表达升高的有265个,表达降低的有372个;2)感觉神经损伤后差异蛋白数量为626个,表达升高的有258个,表达降低的有368个。结论成功筛选出大鼠运动神经与感觉神经损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供支持。

iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术筛选前列腺癌差异表达蛋白

目的应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(2DLC-MS/MS)筛选前列腺癌差异表达蛋白。方法将前列腺穿刺活检的组织标本分为三组:良性前列腺增生组(20例)、前列腺癌组(20例)以及前列腺上皮内瘤组(10例)。对这些组织标本进行蛋白提取、定量和酶解。iTRAQ标记后(其中114标记良性前列腺增生组,116标记前列腺癌组,117标记前列腺上皮内瘤组),进行2DLC-MS/MS分析。利用ProteinPilot软件(版本3.0)对MS/MS肽段进行分析,在International Swissprot(090210,human)数据库中搜寻蛋白并定量。差异表达蛋白界值设定:大于1.5倍或小于0.66倍且P<0.05认为二者之间存在显著差异表达。Western-blot进一步验证了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu、Decorin的表达。结果总共鉴定出760种蛋白。相对于良性前列腺增生,前列腺癌差异表达蛋白共有46个,其中有20个蛋白明显上调,26个蛋白明显下调。Western-blot的验证结果与这些蛋白的表达变化相符合。结论通过iTRAQ技术分析得到的前列腺癌差异表达蛋白可靠,iTRAQ技术为筛选出有意义的前列腺癌生物标记物提供了一个良好的平台。

结核分枝杆菌异烟肼耐药株和敏感株亚细胞蛋白质组差异研究

目的研究结核分枝杆菌异烟肼耐药株和敏感株亚细胞蛋白质组差异，鉴定菌体细胞壁蛋白和细胞膜蛋白中与异烟肼耐药相关的蛋白，并初步探讨其在临床检验中的应用价值。方法应用密度梯度离心法分离5株异烟肼耐药株和5株敏感株的细胞壁和细胞膜蛋白，利用二维液相色谱分离技术进一步获得耐药株和敏感株的亚细胞蛋白表达差异图谱。运用基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱技术对获得的1280个细胞壁和细胞膜组分进行质谱鉴定，并运用DAVID数据库中GO注释功能对鉴定到的蛋白进行细胞成分和生物过程的注释和分类。运用NASF技术对蛋白表达进行定量，报告阈值为1．5。选取5个在耐药株中表达上调、2个在敏感株中表达上调的蛋白分别与菌株来源患者的血清进行ELISA检测，检测上述组分与血清样品发生免疫应答的强度，组问比较采用t检验。结果共鉴定到347个蛋白。蛋白定位分析表明58％蛋白定位于细胞膜或跨膜。蛋白功能聚类分析表明31％蛋白参与三羧酸循环，26％、15％蛋白分别参与脂类、脂肪酸生物合成和代谢，28％蛋白参与脂质体的生物合成、代谢、转运和定位。其中琥珀酰氯化胆碱合酶、单加氧酶、假想蛋白Rv2255c、烟碱核苷二甲基联苯酰磷酸核酮糖激酶、膜磷脂胞嘧啶转移酶在耐药株中表达上调，含有上述蛋白的组分与感染耐药株患者的血清免疫学反应的吸光度（A450值）明显高于与感染敏感株患者的血清免疫学反应强度，差异有统计学意义（t值分别为0．028、0．044、0．066、0．064、0．083，P均〈0．01）。Rv2002蛋白A链、Rv2632e蛋白A链在敏感株中表达上调，含有上述蛋白的组分与感染敏感株患者的血清免疫学反应的A柏。值明显高于与感染耐药株患者的血清免疫学反应强度，差异有统计学意义（t值分别为0．053、0．073，P均〈0．05）。结论运用密度梯度离心法和二维液相色谱-质谱技术能在亚细胞水平上富集并鉴定结核分枝杆菌异烟肼耐药株和敏感株中表达有差异的蛋白。有助于寻找异烟肼耐药株感染相关的抗原蛋白，为进一步探讨结核分枝杆菌耐异烟肼机制、研究耐药株-宿主相互作用提供了有价值的线索。

阿莫西林胶囊热降解聚合物杂质的2D-HPLC分析及质谱裂解机理探讨

目的:建立阿莫西林胶囊中热降解聚合物杂质的分析方法。方法:采用高效凝胶排阻色谱法(HPSEC法),使用Shimpack Bio Diol-60(4.6 mm×300 mm,3μm)二醇基高纯硅胶色谱柱,进样量为20μL并以254 nm为检测波长,进行阿莫西林和聚合物杂质的分离。通过优化HPSEC中流动相pH、缓冲盐浓度、有机相比例等色谱条件,结合阿莫西林13个杂质对照品,考察不同杂质的出峰规律。采用高效二维液相色谱法(2D-HPLC法),使用500μL样品环将HPSEC分离所得聚合物杂质通过中心切割转移到二维反相色谱中脱盐,二维采用质谱兼容流动相,高分辨质谱分析确认结构。结果:HPSEC法中流动相pH是影响阿莫西林与聚合物峰分离的关键因素。杂质对照品在HPSEC的保留时间研究表明色谱分离未严格按照相对分子质量大小的顺序进行。通过对聚合物杂质K和J的质谱裂解行为研究揭示了β-内酰胺类抗生素的一般裂解规律。2D-HPLC法对阿莫西林热降解溶液深入分析,主峰前聚合物峰在二维进一步分离出14个化合物,为阿莫西林二聚体、三聚体、四聚体及其异构体。结论:HPSEC与RP-HPLC结合组成的二维色谱高分辨质谱系统可作为更精准的聚合物发现的手段。