金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因(FdDFR1)的克隆及序列分析

【目的】克隆金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因(FdDFR1),分析其序列特征。【方法】利用同源克隆的原理,采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆DFR基因(FdDFR1);对其序列进行生物信息学分析和Southern杂交检测。【结果】克隆到一个DFR蛋白基因(FdDFR1),通过Southern杂交分析,推测在金荞麦基因组中DFR基因是1～2个基因的小家族,FdDFR1是单拷贝基因;FdDFR1基因编码一个长341个氨基酸的蛋白质,在N端存在一个NADP结合位点"VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY",还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序"TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV"。【结论】首次从金荞麦中克隆到类黄酮代谢的中期关键酶基因(FdDFR1),它具有DFR同源基因的典型特征。

二氢黄酮醇-4-还原酶在花青素合成中的功能及调控研究进展

植物色素主要有花青素、类胡萝卜素和生物碱类色素三大类,其中花青素是决定大部分被子植物组织或器官颜色的重要色素。花青素通过类黄酮途径合成,该途径是生物学上研究较多且较为清楚的代谢途径之一。近年来的研究表明,在该途径中除了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)和黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydrolase,F3H)起着关键作用外,二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)对花青素的合成也至关重要。DFR可催化3种二氢黄酮醇和2种黄烷酮生成5种不同的花青素前体,且DFR基因家族不同成员对各个底物的催化效率不同,因此它在一定程度上决定着植物中花青素的种类和含量,从而影响植物组织或器官的颜色。该文对近年来国内外有关DFR在花青素合成过程中的生物学功能与调控,包括DFR的特征、作用机制和系统进化以及环境、转录因子和一些结构基因与DFR的关系等方面的研究进展进行了综述,以期为DFR今后的研究和利用基因工程改变植物组织或器官的颜色提供理论依据。

芥菜型油菜4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析

利用同源克隆方法,在芥菜型油菜中克隆了DFR基因。在DNA和cDNA中扩增的DFR基因大小分别为1612bp和1214bp。该基因含有5个内含子,开放阅读框为1158bp,预计编码385个氨基酸,预测分子量为42886.0Da,推测的等电点为5.54。DFR基因在芥菜型油菜紫叶芥和黑籽近等基因系的叶片、胚和种皮中都表达,在四川黄籽中只在叶片和胚中表达。DFR基因在四川黄籽种皮中不表达,导致种皮中花色素和原花色素不能合成,从而种皮透明,形成黄籽,因此DFR基因是油菜种皮颜色形成途径中一个关键基因。本研究为利用该基因与种子、种皮特异启动子构建反义表达载体或RNAi载体,阐明油菜种皮颜色形成的分子机理和创造黄籽油菜新种质奠定了基础。

紫心甘薯二氢黄酮醇4-还原酶基因表达及酶活性与花色苷积累的相关性

【目的】以块根着色部位和程度不同的2个紫心甘薯品种(系)‘A5’和‘山川紫’以及白心甘薯品种‘禺北白’为试材,研究紫心甘薯二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因表达及其酶活性与花色苷积累的相关性。【方法】对紫心甘薯在不同生长时期各器官(叶、茎、块根)的花色苷含量和DFR的活性进行了测定,对二者之间的变化趋势进行了相关性分析。此外,通过实时荧光定量PCR检测了‘A5’、‘山川紫’和‘禺北白’块根中IbDFR的表达量以及不同发育时期的山川紫块根中IbDFR的表达量,并测定了相应的花色苷含量变化。【结果】在同一生长时期的各品种(系)甘薯中,着色程度深的器官,其花色苷的含量较高,DFR活性也较高,不同器官的DFR活性与相应的花色苷含量呈显著线性正相关;在不同的生长时期,3个品种(系)甘薯各器官的花色苷含量与DFR活性的变化趋势相一致,并且呈显著线性正相关;3个品种(系)甘薯中,着色程度深的块根,其花色苷的含量较高,IbDFR的表达量也较高;在‘山川紫’块根的3个发育阶段,随着根的膨大,花色苷含量逐渐升高,IbDFR的表达量也逐渐增大。【结论】在不同生长时期的甘薯各器官中,DFR活性与花色苷含量均呈线性正相关,且紫心甘薯块根中IbDFR表达量的变化与其花色苷含量的变化趋势相一致,说明DFR是紫心甘薯花色苷合成代谢过程中的关键酶;紫心甘薯花色苷是原位合成的。

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。

杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响

为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。

植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶,在花色的修饰中起重要作用。我们简述了DFR基因及其调节基因的研究进展,构建的系统进化树体现了部分单子叶与双子叶植物间的亲缘关系与进化差异,阐述了DFR调控基因的调控机制及DFR基因的应用前景。

彩色马铃薯二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及生物信息学分析

花色素苷是影响花色的主要色素,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是花色素苷合成的关键酶基因。本研究以云南地方彩色马铃薯品种‘剑川红’和‘转心乌’,外引品种‘黑美人’为实验材料,通过RT-PCR方法从其块茎表皮中克隆到DFR基因的完整cDNA序列,并进行了生物信息学分析。分析结果显示供试的三个彩色马铃薯的DFR基因编码381个氨基酸,具有完整的开放式阅读框(ORF),DFR与NADPH的结合位点、底物特异性选择结合位点高度保守。同源比对表明,三个彩色马铃薯品种的核苷酸相似性为99.24%,氨基酸同源性为98.78%,与茄科的烟草、矮牵牛等的同源性均在86%以上。三个彩色马铃薯品种DFR都不具有信号肽,无明显跨膜区域,可能为亲水蛋白,定位于细胞质的可能性最高。α-螺旋和无规则卷曲是DFR的主要二级结构元件,DFR属于NADB-Rossmann superfamily。

3种小麦作物二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的生物信息学分析

为了研究彩色小麦色素合成中相关酶的性质及其基因,对已在NCBI上注册的普通小麦、蓝粒小麦、天蓝偃麦草的二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)核酸和氨基酸序列进行分析。通过生物信息学软件研究3种作物二氢黄酮醇4-还原酶的酶学特性,对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质二级结构和结构域进行预测和推断。结果表明,3种作物二氢黄酮醇4-还原酶基因长度均约为1.0 kb,编码354个氨基酸,三者氨基酸同源性很高。在蛋白质的其他预测中,发现三者均为酸性稳定亲水性蛋白,没有信号肽和跨膜结构域。二级结构以α-螺旋和自由卷曲为主,在进化树中可以看出蓝粒小麦与普通小麦亲缘关系较近。通过分析发现,小麦类作物二氢黄酮醇4-还原酶有着相同的特性,进化比较保守。为进一步研究其他特殊的小麦类作物相关酶及其基因提供理论依据。

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因SrDFR,该片段长246bp,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰SrDFR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量PCR分析表明,SrDFR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因在烟草中的过量表达

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素合成途径中的关键酶,它在花色的修饰中起着很重要的作用,在烟草植物体内过量表达积累后,可能会使烟草的花色加深或变为红色。研究结果表明,通过转基因技术将NtDfr1,NtDfr2基因转入烟草后,获得转基因植株烟草的花色为红色,这与试验预期结果一致。

植物二氢黄酮醇-4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素生物合成途径中的关键酶,在花色的修饰中起重要作用,目前,已从多种植物中分离得到。从DFR基因的结构和作用机制、底物特异性、时空表达模式及花色修饰等方面进行了概括和总结,为DFR基因的进一步研究和利用提供理论依据。

植物二氢黄酮醇4-还原酶的生物信息学分析

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是黄酮类化合物合成途径中的重要酶之一。利用NCBI数据库中已经注册的植物DFR基因核酸以及氨基酸序列,以拟南芥DFR为主,对其组成成分、疏水性/亲水性、蛋白质的二级结构以及三级结构等方面进行分析及预测,结果表明:拟南芥等植物DFR不具有明显的疏水或亲水区域;主要构件为α-螺旋和不规则卷曲;植物DFR在高级结构、活性位点等方面具有较高的保守性。

洋葱二氢黄酮醇-4-还原酶基因的分子克隆

鳞茎的皮色是洋葱的重要经济性状之一。洋葱的二氢黄酮醇-4-还原酶基因AcDFR1的开放阅读框为1 158 bp,编码385个氨基酸残基;具有5个内含子,均符合GT-AG规则。本研究为阐明洋葱皮色形成的分子机制以及开发分子标记奠定了基础。

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR扩增获得其二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)cDNA序列,并通过T载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr的全长cDNA编码序列,其1026bp的全长开放阅读框(ORF)均编码341个氨基酸,并具典型的dfr结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。

桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和花青素合酶(ANS)是植物花青素生物合成途径的2个重要酶类。从鲁桑品种育711号植株中克隆得到MmDFR和MmANS基因,生物信息学分析表明,MmDFR基因的ORF长度为1011 bp,编码336个氨基酸,预测蛋白质分子质量为3951 kD,等电点为534;MmANS基因ORF的长度为1077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为42.23 kD,等电点为5.25;MmDFR和MmANS蛋白的氨基酸序列有很高的保守性。qRT-PCR检测结果表明,MmDFR和MmANS在不同桑种质成熟桑椹中的表达丰度存在显著差异,在同一品种中随着果实成熟,基因的表达水平逐渐提高。结合对桑椹花青素含量的检测,表明桑椹花青素含量与MmDFR和MmANS基因的表达量呈正相关,推测MmDFR和MmANS在桑椹花青素合成途径中具正向调控作用。

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。

高等植物二氢黄酮醇4-还原酶基因研究进展

花青素苷是影响植物花瓣呈色的重要色素,而花色是决定花卉观赏价值和商业价值的一个重要因素。在花青素苷的生物合成过程中,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素苷生物合成下游途径中的第一个关键的酶。因此,DFR在高等植物花色的形成过程中发挥极其重要的作用,是形成花青素苷的一个非常重要的调控点。DFR对3种二氢黄酮醇底物具有选择特异性,但决定DFR底物特异性的分子机制目前仍不十分清楚。该文简单概述了花青素苷生物合成途径及其转录调控机制,并结合作者的工作重点综述了DFR的底物特异性以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的应用。

3种荞麦作物二氢黄酮醇4-还原酶生物信息学分析

利用生物信息学方法对3种荞麦作物甜荞麦、苦荞麦和野生金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)核酸和氨基酸序列进行分析.对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质结构和结构域进行预测和推断.结果表明:3种作物二氢黄酮醇4-还原酶基因长度约为1.0 kb,共编码341个氨基酸,三者氨基酸同源性很高,在蛋白质其他预测中,发现三者均为稳定蛋白,疏水性较强,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,从进化分析表明野生金荞麦与苦荞麦亲缘关系最近.这些预测为探讨荞麦作物黄酮类化合物的合成代谢路径中二氢黄酮醇4-还原酶的特性提供理论依据.

(±)-3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基二氢黄酮醇和(±)-3,5,7-三羟基-4′-甲氧基二氢黄酮醇的全合成

Dihydroxy-7,4′-dimethoxy-dihydroflavonol and （±）-3,5,7-trihydroxy-4′-methoxy-dihydroflavonol were found in many medicinal plants, here we describe a concise synthesis route by selective protection, aldol-condensation, 30% H2O2 epoxidation, cyclization and deprotection from 2,4,6-trihydroxyacetophone and anisaldehyde.