酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

【目的】为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;【方法】构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apa1dn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性。将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况。将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex75分子筛纯化。纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛。【结果】成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apa1dn16蛋白。得到了分子量约为36kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上。质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确。将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶。此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apa1dn16蛋白晶体。【结论】利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apa1dn16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究。

二腺苷四磷酸——一种多功能核苷酸

二腺苷四磷酸（AP4A,diadenosine tetra-phosphate）结构式如图（1）,是1966年 Zamec-nik 发现的,是蛋白合成的第一步,即氨基酸激活反应的副产品。自从1976年 Rapaport 和Zamecnik提出 AP4A 可能作为细胞内调控细胞分裂的一种信号核苷酸以来,有关 AP4A 的研究工作越来越多。至今巳确信 AP4A 广泛地存在于多种生物体内(如细菌、原生动物。

^(99)Tc^m-Ap4A显像探测动脉粥样硬化斑块的动物实验研究

目的 探讨应用二磷酸腺苷 (ADP)的类似物99Tcm 四磷酸二腺苷 (Ap4A)显像探测动脉粥样硬化斑块的可行性。方法 采用酒石酸亚锡还原99TcmO- 4 标记Ap4A ,柱层析纯化 ,纸层析鉴定放射化学纯度。观察99Tcm Ap4A在昆明小鼠体内的生物分布并测定动脉粥样硬化模型家兔病灶斑块 血液、病灶斑块 无斑块动脉壁的放射性比值 ,进行腹主动脉宏观放射自显影及正常家兔及动脉粥样硬化家兔体外体内显像。结果 99Tcm Ap4A的放射化学纯度为 85 %～ 91%。99Tcm Ap4A在小鼠血液内清除迅速。注射99Tcm Ap4A后 30min粥样硬化组靶 血比值达 3.17± 1.2 7,靶 非靶比值为 5 2 3± 1.87。粥样硬化组自显影胶片上的曝光黑影与肉眼可见的动脉粥样硬化斑块有良好的一致性。体外显像 :正常家兔组腹主动脉未显影 ,粥样硬化组腹主动脉放射性浓聚清晰可见。体内显像 :粥样硬化组家兔的腹主动脉在注射99Tcm Ap4A后 15～ 30min与正常家兔组相比放射性浓聚明显增强 ,并持续到注药后 3h。结论 99Tcm Ap4A是一种有潜力的可快速显示动脉粥样硬化斑块形成的显像剂。