酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

【目的】为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;【方法】构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apa1dn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性。将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况。将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex75分子筛纯化。纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛。【结果】成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apa1dn16蛋白。得到了分子量约为36kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上。质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确。将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶。此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apa1dn16蛋白晶体。【结论】利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apa1dn16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究。

基于化学成分差异的不同干燥方式熊胆粉镇痛作用研究

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结合的手段研究熊胆粉的化学成分差异;借助PharmMapper、Uniprot、GeneCards数据库及文献,获取熊胆粉成分和病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的作用靶点,并采用动物试验对其药效进行验证;对疾病靶标-药物靶标集做拓扑分析获得核心靶标,并进行基因本体(GO)功能和基因与信号通路分析(KEGG)通路富集,通过Cytoscape3.8.2软件构建成分-靶标-通路网络图。结果常压干燥、减压干燥熊胆粉共有成分721个,差异成分8个(L-焦谷氨酸、鸟苷5′-单磷酸水合物、5,6-二氢胸腺嘧啶、7-甲基黄嘌呤、左旋甲状腺素、甲基间酪氨酸、大黄素8-葡萄糖苷、益母草碱),搜索得到差异成分潜在靶点共1605个;检索得到病毒性肝炎靶点7444个、胆囊炎靶点636个、冠心病靶点7563个;熊胆粉对病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的共同靶点有282个,GO功能富集分析得到GO条目759个(P<0.05),其中生物过程(BP)条目717个,细胞组成(CC)条目21个,分子功能(MF)条目21个;熊胆粉中的鸟苷5′-单磷酸水合物、甲基间酪氨酸、左旋甲状腺素及大黄素8-葡萄糖苷等成分可能通过二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase,DLD)、过氧化氢酶(atalase,CATC)及一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)等靶点,调节代谢通路和癌症通路等信号通路发挥其镇痛作用。药效试验结果表明常压、减压干燥熊胆粉均对热板及醋酸所致小鼠疼痛有抑制作用,且减压组镇痛作用强于常压组,有显著性差异(P<0.05)。结论干燥方式使得熊胆粉化学成分变异,从而导致其镇痛作用差异,初步探索了熊胆粉镇痛作用的机制,建议大生产中采用减压干燥制备熊胆粉,为熊胆粉合理应用提供了一定依据。