MTT法用于中药成分细胞毒性和增殖检测的干扰因素及控制措施

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法具有操作简单和成本低廉等优点,被广泛应用于中药成分的细胞毒性和对细胞增殖影响等研究。然而,细胞的数量和密度、MTT浓度和作用时间等实验条件会干扰检测结果的准确性。另外,由于中药成分种类繁多而且化学结构复杂,可能导致吸收光谱漂移、形成近似检测波长的吸收峰及干扰细胞代谢的活性等,影响MTT检测结果的准确性。对近年的相关文献进行整理,归纳和分析了影响MTT实验的实验条件、优化措施和质量控制,归类了检测需要注意的某些中药成分,总结了替代MTT法的其他实验及MTT与其他实验的联合应用,对应用中存在的问题进行了探讨和展望,期望为MTT法在中药成分相关实验中的合理应用提供参考。

MTT法检测蕲艾鞣酸体外抗肿瘤的活性

目的:探讨蕲艾鞣酸对人体肿瘤的治疗作用。方法:采用超声提取方法对蕲艾鞣酸进行提取,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)在体外检测不同浓度的蕲艾鞣酸对人肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用。在此基础上通过大孔树脂柱层析对蕲艾总鞣酸正丁醇部位提取分离,得到5个不同极性的鞣酸馏分,并通过MTT法比较不同极性的各提取物对肝癌细胞的抑制活性。结果:蕲艾鞣酸使体外培养的人肝癌细胞HepG2的增殖效率下降,且呈浓度与时间的依赖关系,具有一定的细胞毒性。结论:5个不同极性的提取物均具有抑制肝癌细胞生长的作用,其中40%甲醇部位对肝癌细胞的生长抑制作用最强,是蕲艾鞣酸体外抗肝癌肿瘤主要的活性部位。

环孢素A和他克莫司对肾移植受者外周血淋巴细胞活性影响的比较

目的:肾移植术后应用Calcineurin抑制剂需常规监测血清药物浓度,然而药物浓度并不能完全反应患者的免疫功能抑制状态,且药物的个体反应性差异较大,本研究旨在通过外周血单核细胞(PBMC)活性检测反应患者对Calcineurin抑制剂的敏感性。方法:采取40例肾移植受者术前抗凝血,Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,置于RPMI1640培养基中培养,加入96孔培养板中予刀豆蛋白A刺激,并依次加入不同浓度的环孢素A(CsA)或他克莫司(TAC),之后加入二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)裂解后于波长570nm下测定吸光度。记录受试者肾移植后的急性排斥反应和巨细胞病毒感染等临床事件。结果:①受试者半数PBMC被抑制的药物浓度即为IC50。CsA和TAC的IC50均值分别为162.3ng/ml、0.289ng/ml,TAC对PBMC转化的抑制作用显著强于CsA;②Kendall相关系数分析示CsA的IC50与TAC的IC50之间有显著的相关关系(rk=0.3472,P=0.0082);③CsA治疗组急性排斥反应发生率显著高于TAC组,而两组患者巨细胞病毒感染发生率差异不明显。结论:TAC抑制人PBMC母细胞转化能力约为CsA的589.1倍,因而TAC治疗的肾移植受者术后急性排斥反应发生率显著较低。将术前淋巴细胞的体外药敏试验与术后治疗性TDM合理结合,是改进个体化免疫抑制方案的举措之一。

杨梅叶精油成分分析及其对肺癌A549细胞增殖的抑制作用

【目的】比较分析‘丁岙梅’‘东魁’‘晚稻杨梅’和‘荸荠种’4个品种杨梅叶精油的成分与抗癌活性差异。【方法】以水蒸气蒸馏法提取4种杨梅叶精油,采用GC-MS技术分析其组成成分,并以3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTT法)评价了4种杨梅叶精油对肺癌A549细胞增殖的抑制活性。【结果】经GC-MS分析,‘丁岙梅’‘东魁’‘晚稻杨梅’和‘荸荠种’4种杨梅叶精油分别鉴定出34、33、41和33种成分,包括萜烯、萜醇和萜醚3大类主要成分和脂肪醛、烷酮和酚等微量成分。‘丁岙梅’‘东魁’‘晚稻杨梅’和‘荸荠种’4种杨梅叶精油中共有的成分为11种,特有成分分别为7、6、9和5种。β-石竹烯(12.85%~23.87%)、α-葎草烯(19.27%~24.255%)、橙花叔醇(1.15%~23.47%)、氧化香橙烯(3.82%~7.51%)、氧化石竹烯(2.93%~5.26%)和d-杜松烯(0.8%~5.2%)是杨梅叶精油中的主要成分,但含量存在显著差异。根据MTT结果,‘丁岙梅’‘东魁’‘晚稻杨梅’和‘荸荠种’4种杨梅叶精油对肺癌A549细胞增殖抑制作用均存在时间和剂量依赖性,作用24 h后A549细胞半数致死量IC50分别为127.24、127.14、118.03和123.62μg·m L-1,‘晚稻杨梅’叶精油的抗增殖活性略优于其他3种杨梅叶精油。【结论】‘丁岙梅’‘东魁’‘晚稻杨梅’和‘荸荠种’4种杨梅叶精油成分差异显著,对肺癌A546细胞增殖抑制活性较强,不同品种间无显著差异(p>0.05)。

种植合金CPTi和Ti-6Al-4V对内皮细胞增殖的影响及在细胞培养液中腐蚀情况分析

目的 3(-4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法体外评价CPTi和Ti-6Al-4V牙科种植体材料对人脐静脉血管内皮细胞(HU)增殖的影响,并检测这两种材料在细胞培养液中的腐蚀情况。方法将HU(2×104/mL)接种于CPTi和Ti-6Al-4V金属表面,电镜观察细胞接种初期的形态,MTT法检测细胞接种后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d所测的OD值,X射线光电子能谱分析(XPS)法分析2种金属在细胞培养液浸泡前后的表面层组元。结果采用SPSS13.0软件分析,细胞接种后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d所测的OD值表明2种材料没有统计学差异(P<0.05);接种后6 h电镜下可以观察到细胞在CPTi和Ti-6Al-4V表面的形态基本类似,没有明显的形态和数量差别出现;XPS结果显示2种合金表面都有不同厚度的钝化膜形成,CPTi表面的钝化膜要比Ti-6Al-4V的厚一些。结论 CPTi和Ti-6Al-4V对HU的增殖没有影响,在培养基中也没有发生腐蚀。

microRNA-107在喉癌组织中的表达及临床意义

目的检测microRNA-107(miR-107)在喉鳞状细胞癌中的表达,初步探讨其在喉鳞状细胞癌发病中可能发挥的作用。方法收集40例喉癌及其癌旁临近正常组织标本,运用RT-qPCR检测miR-107的表达水平,并分析其表达与喉癌患者临床病理特征的相关性。在人喉癌细胞系TU212及TU686中过表达和敲减miR-107,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测其对喉癌细胞增殖能力的影响。结果miR-107在喉癌组织中的表达低于其临近正常组织,差异有统计学意义(P<0.05),miR-107的表达水平与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移和原发部位均有相关性(P<0.05)。细胞实验结果显示,过表达miR-107后喉癌细胞的增殖能力下降(P<0.05);而敲减miR-107后细胞增殖能力增强(P<0.05)。结论miR-107在喉癌中表达下调,其低表达与喉癌细胞增殖效率密切相关,miR-107可能在喉癌患者体内扮演着抑癌基因的角色。

黄独乙素抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖作用

目的研究黄独乙素(Diosbulbin B)对人胃癌SGC-7901细胞增殖的体外抑制作用。方法 MTT法测定黄独乙素对SGC-7901细胞增殖的影响。结果 10、20、40、80μmol/L的黄独乙素作用24 h后对SGC-7901细胞增殖抑制率分别为12.48%、30.10%、43.02%和51.41%,半数抑制浓度(IC50)为(64.09±1.81)μmol/L。结论黄独乙素在体外对人胃癌SGC-7901细胞增殖有明显的、呈剂量依赖性的抑制作用。

石榴皮提取物对Caco-2细胞生长抑制作用实验

目的探讨石榴皮提取物对人源性结肠癌细胞Caco-2的体外抑制作用。方法培养人源性结肠癌细胞Caco-2,制作石榴皮提取物并配置成不同浓度的提取液,将这些不同浓度的石榴皮提取液加入到培养至对数生长期的Caco-2细胞中,一段时间后,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)对给予不同浓度石榴皮提取物的肿瘤细胞进行染色,观察不同浓度石榴皮提取物对Caco-2细胞生长抑制程度,并计算抑制率。结果石榴皮提取物在8 g/L时对Caco-2细胞有较强的抑制作用,24、48、72 h的细胞生长抑制率分别为(50.65±5.18)%、(57.21±2.07)%、(69.88±2.14)%;在72 h时对Caco-2细胞的IC50是2.89 g/L。结论石榴皮粗提物在高浓度时具有良好的抑制Caco-2细胞增殖的作用。

普伐他汀对新生大鼠成骨细胞的作用研究

目的研究普伐他汀对新生大鼠成骨细胞的作用。方法用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT）、4-硝基苯磷酸二钠法（PNPP）、茜素红染色法分别检测普伐他汀对成骨细胞的活力,碱性磷酸酶（ALP）活力及骨矿化结节面积的作用。结果普伐他汀在10-8~10-4 g/ml能促进成骨细胞增殖、提高成骨细胞碱性磷酸酶活性和促进新生大鼠成骨细胞骨结节形成。结论普伐他汀能促进成骨细胞增殖、分化及矿化。

纳米材料体外细胞毒性试验标准的关键项目研究

目的:参考ASTM标准,研究纳米材料体外细胞毒性检测方法(MTT试验和LDH试验)中的关键项目指标,为制定纳米材料体外细胞毒性试验标准提供实验依据。方法:通过全波长扫描获得MTT试验和LDH试验的检测波长;测试阳性对照品APAP的使用剂量和保存条件;通过改变MTT试剂的配制介质,以及DMSO溶解后加入和不加入甘氨酸缓冲液来测试MTT试验条件;考察含不同浓度血清(10%,5%,2.5%)的细胞培养液对LDH试验的背景影响;在确定优化的实验条件下用MTT试验和LDH试验,对某纳米银凝胶产品进行细胞毒性评价。结果:MTT试验和LDH试验在测定吸光度时双波长可分别设定为540～570/680 nm和490/680 nm。APAP作为阳性对照的合适浓度为20～30 mmol.L-1,该溶液保存条件为-20℃,14 d内有效。血清对LDH试验的干扰与浓度呈正相关,为确保细胞正常生长,该方法中血清浓度确定为10%,血清造成的背景值干扰可从空白组扣除。纳米银凝胶产品MTT试验和LDH试验结果(IC50)分别为26.8 mg.mL-1和61.8 mg.mL-1。结论:MTT试验和LDH试验相结合可以在1个实验体系内获得2个检测结果,能够更全面地评价纳米材料可能引起的细胞毒性。本课题确定了纳米材料体外细胞毒性检测方法(MTT试验和LDH试验)的关键项目指标,使该方法具有良好的操作性与可行性。

重组人粒细胞刺激因子测活方法中几种常见显色方法的对比分析

目的分析重组人粒细胞刺激因子生物学活性检测中,以NFS-60细胞为测活基础的几种常见显色/裂解/检测方法,所得检测结果是否一致。方法应用NFS-60细胞/MTT染色法、NFS-60细胞/MTS染色法、NFS-60细胞/CCK-8染色法、NFS-60细胞/化学发光法等检测重组人粒细胞刺激因子生物学活性,并对结果进行统计分析。统计分析了NFS-60细胞/MTT法双波长(570 nm检测,630 nm参比)、单波长(570 nm检测和630 nm检测)结果。分析比较了NFS-60细胞/MTS动态检测法、NFS-60细胞/CCK-8动态法检测结果。结果各生物学活性检测方法的检测结果差别不显著(P>0.05);NFS-60/MTT法双波长、单波长检测结果差别不显著(P>0.05)。NFS-60细胞/MTS动态检测法、NFS-60细胞/CCK-8动态法与NFS-60细胞/MTT染色法检测结果间差别不显著(P>0.05)。结论以NFS-60细胞为测活基础的几种常见的显色/裂解/检测方法,所得检测结果一致,为各实验室(应用不同显色/裂解/检测方法)给出的数据是否可以综合利用提供依据,为2015年版《中国药典》中重组人粒细胞刺激因子生物学活性检测方法的扩充提供支持,也为其他细胞因子生物学活性检测方法的扩充提供借鉴。