二草清肝汤含药血清对人源HL-7702肝细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探究二草清肝汤(EQD)含药血清对脂多糖(LPS)诱导的人源HL-7702肝细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:制备急性肝衰竭小鼠模型,分组后分别对各组小鼠以相应剂量EQD和生理盐水进行灌胃,末次注射LPS 24h后,提取含药血清备用;采用LPS诱导人源HL-7702肝细胞建立细胞凋亡模型,随机分为空白对照组、LPS组、LPS+EQD低剂量组、LPS+EQD中剂量组、LPS+EQD高剂量组,分别采用相应剂量的含药血清100μL预处理2h后,然后再加入10μg/mL的10μL LPS处理24h,空白对照组予相同剂量的生理盐水。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光法观察GSK3β核易位情况,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测兔抗人单克隆抗体(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达,Western-blot法检测HL-7702细胞内AKT、p-AKTS、GSK3β、p-GSK3β的表达。结果:与空白对照组比较,LPS处理后,HL-7702凋亡率显著上升(P<0.05);经低、中、高EQD处理后,结果显著下降(P<0.05)。免疫荧光检测显示,GSK3β主要在HL-7702细胞质表达;与空白对照组比较,LPS处理后,HL-7702中GSK3β表达显著上升,且趋向于向细胞核中聚集(P<0.05);经低、中、高EQD分别处理后,表达显著下降且趋向于向细胞质中聚集(P<0.05)。qPCR检测显示,与对照组比较,LPS处理后,HL-7702细胞中Bax、TNF-α、IL-6显著上升,Bcl-2表达显著下降(P<0.05);经低、中、高EQD处理后,前者显著下降,后者显著上升(P<0.05)。Western-blot检测显示,与对照组相比,LPS处理后,AKT、GSK3β、p-AKT、p-GSK3β表达显著上升(P<0.05);经低、中、高EQD处理后,AKT、GSK3β表达显著上升(P<0.05),其余表达显著下降(P<0.05)。结论:EQD预处理可以显著降低LPS诱导的人源HL-7702肝细胞凋亡率,其机制可能与抑制TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信号通路有关。

二草清肝汤治疗免疫性肝损伤大鼠的作用机制

60只健康雄性SD大鼠随机分为5组,正常组、模型组、环磷酰胺(CTX)组(12.6 mg/kg)、二草清肝汤小剂量组(3 ml/kg)和二草清肝汤大剂量组(6 ml/kg)。检测各组血清ALT、AST和TNF-α、IL-12的变化,流式细胞仪检测肝细胞凋亡,免疫组化法检测肝细胞bax、bcl-2蛋白的表达。发现二草清肝汤大剂量组、小剂量组、CTX组ALT、AST、TNF-α、IL-12、凋亡率、bcl-2、bax阳性表达和bax/bcl-2较模型组降低。认为二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤具有保护作用,降低血清TNF-α、IL-12水平和抑制肝细胞凋亡可能是其作用机制之一。

二草清肝汤对内毒素性肝损害防护作用的实验研究

目的:探讨中药二草清肝汤对内毒素/脂多糖(LPS)性肝损害的防护机制。方法:采用LPS腹腔注射(10mg/kg)制备小鼠内毒素血症肝损害模型,BALB/c小鼠200只随机分为正常对照组、LPS组、二草清肝汤小剂量组和二草清肝汤大剂量组;光镜观察肝组织病理学改变,全自动生化分析仪检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,酶联免疫吸附法检测血浆白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度,免疫组织化学法检测Toll样受体4(TLR4)表达水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织TLR4 mRNA表达水平。结果:二草清肝汤能明显提高小鼠存活率,肝组织病理损害程度减轻;二草清肝汤小剂量组及大剂量组小鼠的IL-12、TNF-α水平显著低于LPS组,差异有显著性意义(均P(0.05);二草清肝汤小剂量组和大剂量组小鼠肝组织TLR4 mRNA水平也明显低于LPS组,差异均有显著性意义(均P(0.05),但二草清肝汤大、小剂量组间差异无显著性意义(P>0.05)。结论:二草清肝汤能明显减轻LPS所致的肝损害,其机制可能与其下调肝脏各种细胞的TLR4表达,同时下调IL-12、TNF-α的水平有关。

二草清肝汤预防小鼠内毒素性肝损伤观察及对肝脏TLR4表达的影响

目的:观察二草清肝汤对小鼠内毒素血症急性肝损伤的影响及Toll样受体4(toll-Likereceptor4 TLR4)表达的影响。方法:取BALB/c小鼠120只,随机分为正常对照组、内毒素肝损伤模型组及二草清肝汤大、小剂量组,各30只。二草清肝汤大、小剂量组分别予二草清肝汤6mg/kg、3mg/kg预防性灌胃,正常对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃,1天1次。12天后除正常对照组外,另三组给予D-氨基半乳糖(D-Gal)和LPS腹腔注射,观察注射后1、2、4、6、12、24h时各组小鼠光镜下肝组织的病理变化,采用全自动生化分析仪检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,酶联免疫吸附法检测血清IL-12、TNF-α浓度,免疫组织化学法检测TLR4表达水平,RT-PCR检测肝组织TLR4 mRNA表达水平。结果:二草清肝汤大、小两个剂量组各个时间点血ALT值、血清IL-12、TNF-a水平均低于同时间点的模型组(P<0.05或P<0.01),TLR4 mRNA水平也明显低于同时间点的模型组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。但二草清肝汤大、小剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:预防性给予二草清肝汤,可抑制内毒素血症肝损伤小鼠肝脏炎症反应,其机制可能与下调LPS识别受体TLR4表达,并进而抑制下游炎症因子分泌有关。

二草清肝汤抗大鼠免疫性肝损伤作用机制的研究

目的:观察中药二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤的防护作用并探讨其药理学机制。方法:采用卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)建立大鼠免疫性肝损伤模型。做肝组织病理切片观察肝组织损伤情况;采用免疫组化法检测肝组织Bax、Bcl-2的表达;ELISA法检测血清IL-12水平。结果:大鼠免疫性肝损伤时,血清IL-12水平显著升高;肝脏Bax表达明显升高,Bcl-2表达显著降低;中药组及西药(环磷酰胺)对照组大鼠Bax的表达及IL-12水平明显低于模型组(P<0.01),而Bcl-2表达明显高于模型组(P<0.01);中药组和西药组大鼠肝组织病理改变较模型组明显减轻,中药组一般情况明显好于西药组。结论:二草清肝汤能降低免疫性肝损伤大鼠的血清IL-12水平,下调肝Bax的表达,上调Bcl-2的表达,对实验性免疫性肝损伤有明显防护作用。

二草清肝汤联合恩替卡韦及干扰素治疗湿热中阻型高病毒载量HBeAg阳性慢性乙肝的疗效观察

二草清肝汤是我院治疗湿热中阻型慢性乙肝的常用方，前期已进行多项实验室及临床研究。我们采用二草清肝汤联合恩替卡韦及干扰素治疗湿热中阻型高病毒载量HBeAg阳性慢性乙肝效果显著，本文从炎症因子水平改善情况进行探讨，以更深入地比较各组方案疗效。

二草清肝汤对内毒素性肝损害小鼠防护作用的实验研究

目的:探讨二草清肝汤对内毒素性肝损害小鼠的防护作用及其机制。方法:将200只BABL/c小鼠按随机数字法均分成4组各50只,正常对照组、LPS组、二草清肝汤小剂量组、二草清肝汤大剂量组。二草清肝汤剂量按人与动物体表面积和体质量换算,计算出小剂量组为3 m L/kg,大剂量组为6 m L/kg,灌胃1次/d,共12 d;正常对照组和LPS组小鼠同时予同体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。末次给药4 h后,除正常对照组外所有小鼠均腹腔注射LPS(10 mg/kg)。记录各组小鼠存活率,光镜和电镜观察组织病理学改变,全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶水平,酶联免疫吸附法检测血清中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-10的浓度。结果:正常对照组、LPS组、二草清肝汤小剂量组、二草清肝汤大剂量组的存活率分别为100%、30.0%、75.0%、80.0%,与LPS组相比,正常对照组、二草清肝汤小剂量组、二草清肝汤大剂量组存活率明显升高(P<0.05),肝脏病理损害程度和死亡率减轻,ALT水平明显下降;比较各模型组小鼠血清中TNF-α和IL-10的结果(同时间点比较,二草清肝汤大、小剂量组TNF-α含量低于LPS组,IL-10则相反),二草清肝汤大、小剂量组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:预防性给予二草清肝汤能抑制内毒素性肝损伤小鼠肝脏炎症反应,明显减轻LPS所致的肝损害,其机制可能与降低TNF-α水平和增高IL-10水平有关。

二草清肝汤对免疫性肝损伤大鼠细胞因子表达的影响

目的:观察中药二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤的保护作用并探讨其药理学机制。方法:采用卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)建立大鼠免疫性肝损伤模型。肝组织病理切片观察肝组织损伤情况;采用ELISA法检测血清IL-10及IL-12水平。结果:大鼠免疫性肝损伤时,血清IL-10及IL-12水平显著升高;中药组及西药对照组(环磷酰胺)IL-10及IL-12水平明显低于模型组(P<0.01),中药组和西药组肝组织病理改变较模型组明显减轻,中药组一般情况明显好于西药组。结论:二草清肝汤能降低免疫性肝损伤大鼠的血清IL-10及IL-12水平,对实验性免疫肝损伤有明显保护作用。

二草清肝汤对湿热中阻型慢性乙型病毒性肝炎活动期患者Hs-CRP、AFP、HBV-DNA及肝功能的影响

目的:探讨二草清肝汤加减在湿热中阻型慢性乙型病毒性肝炎活动期患者治疗中的应用价值。方法:所有湿热中阻型乙肝活动期患者均于2017年6月至2020年7月在温州市中医院就诊并随机分组,对照组42例采用西医常规治疗,观察组42例在对照组基础上联合二草清肝汤加减治疗,治疗4周后比较疗效。结果:治疗后观察组血清超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、甲胎蛋白(AFP)低于对照组(P<0.05);观察组血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、HBV-DNA低于对照组(P<0.05);观察组生活质量评分高于对照组,中医总症状积分低于对照组(P<0.05);观察组总有效率97.62%,高于对照组的76.19%(P<0.05)。结论:对于湿热中阻型乙肝活动期患者而言,联合二草清肝汤加减有助于减轻肝脏炎症反应,提高临床疗效。

二草清肝汤联合干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效观察

干扰素或核苷类药物均通过抗病毒治疗抑制或清除乙型肝炎病毒（HBV）治疗慢性乙型肝炎（CHB），延缓疾病进展，降低肝硬化及肝细胞癌的发生几率。笔者应用二草清肝汤联合干扰素治疗慢性乙型肝炎患者，观察前者是否有助增强干扰素的抗病毒、保肝护肝、抗纤维化等作用，并减轻后者的毒副作用，现报道如下。

二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4信号转导通路的影响

目的：探讨二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞的活化及功能依赖TLR4信号传导通路的影响。方法：120只雄性Wistar大鼠,随机分成空白组、模型组、二草清肝汤大剂量（20 g/kg）和小剂量组（10 g/kg）,每组30只,连续灌胃给药12 d。末次给药4 h后,除空白组外所有大鼠腹腔注射D-Gal N（800 mg/kg）/LPS（0.04 mg/kg）诱导内毒素性肝损害,造模后1、2、4、6、12、24 h每组取5只大鼠,Western印迹法检测Kupffer细胞Toll样受体-4（TLR-4）、TIR结构域的衔接蛋白（TRIF）、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达变化。结果：造模后1、2 h,各组大鼠TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达无显著差异。造模后4、6、12、24 h,与空白组比较,模型组大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显增多（P〈0.05）;与模型组比较,二草清肝汤大、小剂量组大鼠肝脏Kupffer细胞TLR-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显减少（P〈0.05）;大、小剂量组同时间比较无显著差异。结论：二草清肝汤可能通过抑制TLR-4信号转导通路的活性发挥其抗炎效应。

二草清肝汤抑制LPS引起肝损伤的TLR4及其下游信号分子表达

目的:研究二草清肝汤(EQD)对内毒素脂多糖(LPS)联合D-氨基半乳糖(D-GalN)致小鼠急性肝损伤模型的:Toll样受体4(TLR4)信号通路的作用。方法:将21只BALB/C小鼠随机分为四个组:空白对照组(n=3)、内毒素模型组(n=7),均给予氯化钠溶液灌胃(3ml/kg);二草清肝汤小剂量组(n=6)、大剂量组(n=5)分别予生药含量为3.3g/ml、6.6g/ml的EQD溶液灌胃(3ml/kg)。每日1次,连续12天。最后一天灌胃4h后,除空白对照组外,其余组所有小鼠均腹腔注射LPS和D-GalN混合液造模,腹腔注射24h后,处死所有小鼠,剖取其肝脏称重、HE染色显微观察病理;各组小鼠TLR4、NF-κB表达情况,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法从RNA水平检测、WB法从蛋白表达水平定量测定;TLR4蛋白表达应用免疫组化法。结果:内毒素性肝损伤小鼠肝重均较空白对照组低,加入二草清肝汤后小鼠肝重上升;病理结果显示空白组小鼠的肝小叶轮廓界限分明、清晰且完整,肝窦散布有序、较宽;肝上皮细胞排列规整、呈多边形;细胞质染色均匀、细胞核清晰、未见明显肿胀变性,库普弗细胞分布均匀,未见周部大量聚集。内毒素模型组中巨噬细胞聚集,肝小叶结构混乱、排列无序;肝细胞脂肪沉积、水肿明显较空白组严重;而二草清肝汤组病变则较前改善。免疫组化结果说明内毒素处理后的模型组中TLR4蛋白表达显著上升,加入大剂量二草清肝汤后TLR4稍有下降(P<0.05);PCR结果显示内毒素处理后的模型组中TLR4、NF-κB mRNA表达下降,加入二草清肝汤后明显上升(P<0.05)。结论:二草清肝汤能够抑制肝细胞内TLR4信号通路的激活及相关炎症分子活化,改善LPS导致的肝损伤,其机制可能是EQD影响TLR4通路关键分子的蛋白翻译过程。

二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤的保护作用及其机制

目的观察中药二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤的保护作用及其机制的初步探讨。方法采用卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)注射制备大鼠免疫性肝损伤模型,共60只大鼠,设正常组、模型组、环磷酰胺(CTX)组、二草清肝汤小剂量组、二草清肝汤大剂量组,检测不同组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转酶(AST)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)的变化,流式细胞仪检测肝细胞凋亡,免疫组织化学方法检测肝细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果二草清肝汤大、小剂量组和CTX组与模型组比较,ALT及AST降低明显,ALT分别为(547±76)、(576±69)、(538±72)、(642±94)U/L,AST分别为(536±72)、(585±74)、(526±71)、(627±92)U/L,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。二草清肝汤治疗组和CTX组TNF-α、IL-12与模型组比较下降显著,差异有统计学意义(P<0.05)。二草清肝汤治疗组、CTX组与模型组比较,肝细胞凋亡率下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);二草清肝汤治疗组、CTX组Bcl-2和Bax阳性表达及Bax/Bcl-2相对比率明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论二草清肝汤对大鼠免疫性肝损伤具有保护作用,降低血清TNF-α、IL-12水平和抑制肝细胞凋亡可能是其作用机制之一。