化学发光物质9-[2′，6′-二甲基-4′-(琥珀酰亚胺氧羰基)苯氧羰基]-10-甲基吖啶-单甲基-磺酸盐的合成

报道了一种化学发光物质吖啶酯衍生物9-[2′，6′-二甲基-4′-（琥珀酰亚胺氧羰基）苯氧羰基]-10-甲基吖啶-单甲基-磺酸盐（DMAE·NHS）的合成，合成共经历7个步骤，每步合成的产物经IR，^1H NMR，MS和元素分析表征，结果表明合成产物为所期望的化合物，该合成产物显示为一种非常理想的化学发光物质。

金岛膜表面二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯分子吸附行为的表面增强红外光谱分析

二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(dithiobis-succinimidyl propionate,DTSP)是一种重要的同源双功能偶联分子,广泛地应用于蛋白质在载体表面的共价固定。研究利用表面增强红外光谱分析了DTSP分子在真空蒸镀金岛膜表面的吸附特性。首先通过密度泛函理论对吸附于金表面的DTSP分子进行了结构优化,计算了该分子的振动模式和红外强度。表面增强红外吸收和变角偏振反射吸收测量结果表明TSP分子在金表面有序排列,其五元杂环平面与金表面法线成65°左右的二面角。此外,表面增强红外光谱还成功地监测到了TSP分子和Nα′,Nα″二(羧甲基)-L-赖氨酸在金表面的实时组装过程。

蛋白A与联硫基二(琥珀酰亚胺丙酸盐)修饰电化学免疫传感器测定雌二醇(英文)

将抗体结合蛋白A和交联剂联硫基二(琥珀酰亚胺丙酸盐)(DTSP)组成的骨架修饰到电极表面,再将单克隆雌二醇抗体与骨架中的蛋白A相结合,制备出电化学免疫传感器.利用样品雌二醇与辣根过氧化酶所标记的雌二醇同传感器表面抗体的竞争性结合,将该传感器用于测定溶液中样品雌二醇的浓度;利用方波伏安法监测电化学还原辣根过氧化酶催化产生的苯醌分子的电流,以还原电流为纵坐标,以雌二醇浓度为横坐标绘制标准曲线.结果表明,雌二醇浓度在50～1 500ng.L-1范围内与方波伏安还原电流呈良好的线性关系,灵敏度为0.51μA.ng-1.L,检测限为50ng.L-1.所制备的免疫传感器良好的分析性能得益于蛋白A和DTSP所组成的骨架,该骨架能够增加免疫分子组分在电极表面的修饰量,并能够控制抗体在电极上的结合方位,使其抗原结合位点朝向电极外端,减少结合空间阻碍.

一种含琥珀酰亚胺酯的双苯乙烯类双光子荧光团的合成

设计和合成一种含琥珀酰亚胺酯的双苯乙烯类双光子荧光团,为进一步合成一系列相关双光子荧光探针提供理论和实验基础。以对二甲苯为原料,分别通过芳环上的亲电取代、亲核取代、自由基取代、wittig-horner等一系列反应合成双光子荧光团2,5-二氰基-1-(4'-二甲氨苯乙烯基)-4-(4'-甲酸琥珀酰亚胺酯苯乙烯基)苯。成功合成了目标化合物2,5-二氰基-1-(4'-二甲氨苯乙烯基)-4-(4'-甲酸琥珀酰亚胺酯苯乙烯基)苯,并经氢谱与熔点测定确认其结构。

辛二酸二琥珀酰亚胺酯交联血红蛋白制备红细胞代用品

探索了用辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)作为分子内交联剂交联血红蛋白的亚基，以制备新型红细胞代用品．采用多角度激光散射检测器(MALLS)与高效液相色谱(HPLC)连接进行检测，辅之以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析反应产物组成．实验在局部百级的洁净室内进行，低温4℃下反应1h，交联产物中83．8％为重均分子量(Mw)66．8kD的分子内交联血红蛋白，16．2％是Mw为146．6和306．4kD的低聚血红蛋白．通过流动相中添加1 mol／LMgCl2的凝胶过滤色谱验证，交联后的血红蛋白在生理环境下不会解聚．联用反相高效液相色谱与质谱(RP-HPLC-MS)初步确定，交联为非定点反应，主要在α-α亚基间进行．交联反应增强了血红蛋白亚基的疏水性，影响了血红蛋白的载氧活性，P50和Hill系数由交联前的21．8和2．22mmHg分别降至14.3和1．41mmHg，仍具有一定的载氧能力．等电聚焦(IEF)电泳表明，制备的DSS交联血红蛋白的等电点降至4．6～5．2之间，接近于不透过血管壁的血清白蛋白．产品经小鼠异常毒性试验证实具有一定的生物安全性，大鼠的换血试验表明DSS交联血红蛋白并未引起血压升高，也未见其他明显的副作用．还对DSS交联血红蛋白与文献已有的双阿司匹林交联血红蛋白的产物特性进行了比较．

葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物的制备及其理化特性观察

目的制备葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亚胺交联物(SPA-PEI交联物),并观察其理化性状。方法采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)化学偶联法将葡萄球菌A蛋白(SPA)与聚乙烯亚胺(PEI)化学交联,用Sephadex G75柱层析法纯化SPA-PEI交联物。采用SDS-PAGE法鉴定交联物的纯度;紫外分光光度法测定交联物的吸收峰;采用粒度及Zeta电位分析仪测定交联物的粒径及表面Zeta电位、酸碱滴定法测定交联物的质子缓冲能力。结果 SPA与PEI共价结合形成SPA-PEI交联物,且交联物的纯度较高。SPA-PEI交联物在280 nm处有一吸收峰,其吸收曲线与SPA类似。SPA-PEI交联物粒径为(185.0±28.5)nm,表明Zeta电位为(38.0±6.6)m V,提示其粒径范围合理,带有较强的正电荷,可结合带负电荷的核酸片段。SPA-PEI交联物的酸碱滴定曲线与PEI类似,均有一个明显的缓冲平台,提示该交联物具有较强的质子缓冲能力。结论成功地制备出纯度良好的SPA-PEI交联物。SPA-PEI交联物粒度分布较合理、表面带较强正电荷、并且具有较强的质子缓冲能力。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记肿瘤细胞及其在细胞毒检测中的价值

目的探讨化学染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）标记肿瘤细胞的最佳条件及其在细胞毒检测中的价值。方法用不同浓度的CFDA-SE标记K562（人红白血病细胞）、YAC-1（小鼠淋巴瘤细胞）、A375（人乳腺癌细胞）、MCF-7（人黑色素瘤细胞）不同肿瘤细胞系，并检测其0—24h的荧光强度，观察荧光强度变化的时间动力学，选择CFDA-SE标记细胞的最佳浓度；CFDA-SE标记细胞后孵育时间为1—6h，再用DNA染料碘化丙啶（PI）标记，流式细胞仪分析CFDA-SE和PI双标记细胞，并计算细胞死亡率，研究CFDA-SE对细胞的毒性。CFDA-SE标记时间分别为5、6、7、8、10、15min，测定标记不同时间的荧光强度和细胞的死亡率，选择最佳标记时间；用CFSE在最佳条件下标记靶细胞进行细胞毒检测实验。结果对于不同肿瘤细胞系，CFDA-SE标记的最佳浓度不同；CFDA-SE对细胞没有毒性，死亡率低于5％；最佳标记时间为8min。人外周血单个核细胞和BALB／c鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞K562、YAC-1均表现出杀伤活性，杀伤百分率随效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4h。结论CFDA-SE具有标记细胞稳定，能用于细胞培养时间较长的研究，不影响细胞功能，适用于流式细胞仪检测细胞毒实验的优点，是一种很好的标记细胞的荧光素染料。

原子转移自由基聚合制备聚甲基丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯及其嵌段共聚物

以CuCl/N-苄基-2-吡啶基甲亚胺(NBPM)/2-溴异丁酸乙酯(EBrIB)作为引发催化体系,使甲基丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯(MASI)进行ATRP聚合,得到的聚甲基丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯(PMASI)具有较高的单体转化率(90%)、较窄PDI(~1.10)和较高的分子量。在整个聚合过程中,较强的C—Cl键仍使聚合物的端基保持活性,有利于与第二单体甲基丙烯酸(N,N-二甲氨基)乙酯(DMAEMA)嵌段共聚形成结构明确的嵌段共聚物P(MASI-b-DMAEMA)。当MASI的链长较短时,P(DMAEMA40-b-MASI16)具有水溶性并可自组装成直径均匀的核-壳型微胶束,间接证明了聚合过程的可控特征。

mIL-21基因转染的Sp2/0瘤苗细胞的抗肿瘤机制探讨

目的:探讨小鼠IL-21瘤苗-Sp2/0-mIL-21抗肿瘤效应的机制。方法:用流式细胞术检测Sp2/0-mIL-2瘤苗细胞表面MHC-Ⅰ类分子及CD80分子的表达。以瘤苗细胞接种BALB/c小鼠,以CFSE,7-AAD标记,用流式细胞术检测NK细胞、CTL的细胞毒活性。观察肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。用RT-PCR检测肿瘤组织中CXC家族趋化因子I-TAC的表达。结果:与对照组相比,瘤苗细胞膜表面MHC-Ⅰ类分子的表达明显上调。瘤苗接种组小鼠NK细胞、CTL的细胞毒活性明显增强。病理分析发现,肿瘤组织中有较多的淋巴细胞浸润并检测到干扰素诱导的T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达上调。结论:肿瘤细胞瘤苗Sp2/0-mIL21可增强小鼠的细胞免疫作用,其抗肿瘤机制可能与T细胞的增殖、活化,促进NK细胞的分化成熟,淋巴细胞向肿瘤组织浸润,以及增强NK细胞和CTL的细胞毒活性有关。

大鼠间充质干细胞的体外分离培养及CFSE标记

目的探讨体外分离、培养及荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法。方法Wistar大鼠10只。用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定。荧光染料CFSE标记MSCs,荧光显微镜检测标记率,CCK-8法检测标记细胞的增殖能力。结果原代MSCs72h贴壁,呈梭形,集落样生长;传代后,细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样。CFSE标记当天,荧光显微镜下大鼠MSCs呈明亮的绿色荧光,标记率达100%,随着培养时间延长,荧光强度逐渐减弱,标记率随之下降,标记4周后,标记率下降至78%;标记细胞的增殖能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;CFSE短期标记MSCs效率很高,且标记细胞的增殖能力不受影响,但荧光强度及标记率随着时间延长而下降。

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的：构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14-507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4＋、CD8＋T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）/碘化丙碇（PI）双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果：PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4＋T细胞数较空质粒（pcDNA3）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8＋T细胞、CD4＋/CD8＋T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论：HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。

利用荧光染料CFSE分选衰老细胞的探究

目的:探究利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行衰老细胞分选的可行性。方法:利用CDK4/6抑制剂LY2835219诱导人口腔鳞癌细胞Cal27衰老,在LY2835219撤药后立即进行CFSE染色,避光培养,并在撤药后第0、2、4、6、8天进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色。通过流式细胞仪分选CFSE荧光强度高的细胞,进行SA-β-gal染色。结果:CFSE荧光标记的细胞与SA-β-gal染色阳性的细胞相一致。撤药后第4、6天利用CFSE荧光进行流式分选,CFSE-high组的细胞SA-β-gal阳性率显著高于未分选组(P<0.05)。结论:利用CFSE分选衰老细胞具有可行性,可获得活的衰老细胞。

人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察

目的:建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,并且在模型中观察黑素小体的转运。方法:分别培养人表皮黑素细胞和角质形成细胞,用二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记黑素细胞内黑素小体,然后将两种细胞共培养,并在倒置显微镜和共聚焦显微镜下观察共培养模型中黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。结果:培养至第3天和第7天可在倒置显微镜下观察到黑素细胞与角质形成细胞共同存活,并通过树突发生联系,在共聚焦显微镜下可直接观察到黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。结论:成功建立黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,并利用CFDA-SE标记,在共聚焦显微镜下直接观察到黑素向角质形成细胞的转运。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393在鼠消化道内定植能力及分布规律的研究

研究了干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393在小鼠肠道中定植能力及分布规律。利用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯分子探针对干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393进行标记,以每只1010mL-1的量,口服途径喂给BALB/c鼠,分别于口服后的第1,3,5,6 d取其十二指肠、空肠、回肠、结肠等肠段,通过流式细胞仪检测肠内的标记阳性菌。实验结果显示:经口服后第5 d,干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393开始在BALB/c鼠肠道中定植,在十二指肠、空肠、回肠、结肠的定植率分别为28.70%,29.77%,15.63%,26.17%,第6 d标记的阳性菌出现明显的生长趋势,阳性检出率分别为71.77%,57.31%,65.44%,53.13%。研究表明干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393具有良好的肠道定植能力。

流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较

目的:比较并优化流式细胞术检测人NK细胞体外细胞毒功能的方法。方法:采用Calcein-AM释放法或CFSE/7-AAD法分别对靶细胞进行标记,按10∶1和20∶1效靶比与7例NK细胞在37℃5%CO2培养箱共培养4 h,流式细胞术测定两种不同标记方法的靶细胞死亡率。结果:各实验组中CFSE/7-AAD法检出的靶细胞死亡率均高于Calcein-AM释放法,在低效靶比、弱细胞毒作用条件下,差异具有统计学意义。细胞毒作用较弱时,Calcein-AM释放法平均荧强度变化不显著、结果误差较大;而CFSE/7-AAD法则能更加敏感地检出靶细胞的死亡率。结论:CFSE/7-AAD法能够特异、灵敏地检出NK细胞的细胞毒活性,所获得的结果更为可靠。

白消一号方作用于黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型中黑素小体转运的观察

目的体外建立黑素瘤细胞与角质形成细胞直接接触的培养模型,观察白消一号方对此模型中黑素小体转运的影响,探讨其治疗白癜风的药理作用。方法体外培养黑素瘤细胞和角质形成细胞,用二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记黑素瘤细胞内的黑素小体,然后将标记的黑素瘤细胞与角质形成细胞共同培养。大鼠中药灌胃后取血清加入此模型中,在倒置显微镜下观察混合细胞模型生长及共聚焦显微镜下观察共培养模型中黑素小体由黑素瘤细胞向角质形成细胞的转运情况。结果含药血清可使黑素小体由黑素瘤细胞向角质形成细胞的转运增加。结论在共聚焦显微镜下观察到白消一号方可以促进黑素小体转运,此途径可能为白消一号方治疗白癜风的作用机制之一。

β-淀粉样蛋白与膜脂作用后的交联研究

β淀粉样蛋白(Aβ)与细胞膜相互作用形成寡聚体存在于膜脂内,聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于分析这些膜内寡聚体的结构和状态,但十二烷基硫酸钠(SDS)使得寡聚体原有的结构极易被破坏,使用合适的交联剂来稳定蛋白在膜上的状态,从而获取寡聚体本身的结构.用双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(BS3)对Aβ42进行交联,将BS3与戊二醛交联进行比较分析,通过电泳、脂质体技术,并采用电镜照片对照分析.实验结果显示:1)BS3交联后的样品能保持蛋白原先的状态;2)BS3不会导致蛋白过度交联,很适合作为分析膜脂与β淀粉样蛋白相互作用的交联剂.因此,报道了BS3分析β淀粉样蛋白这种易聚集蛋白在插膜后的结构,且BS3可以替代戊二醛成为更有效的交联剂,这将为β淀粉样蛋白及其他易聚集蛋白插膜提供很好的研究方法.

BS^3交联分析β淀粉样蛋白的寡聚结构

使用交联剂双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(Bis(sulfosuccinimidyl),BS3)对Aβ1-42进行交联,通过与之前报道的戊二醛交联进行比较分析,可以看出BS3更适合分析蛋白的寡聚状态,这将为Aβ蛋白及类似的易聚集蛋白在体内、外研究提供很好的参考。

小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性检测方法的建立

目的在建立既能保留人肿瘤生物学特性的,且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程中,为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率,摸索建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人HepG2细胞,利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞,用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞,人HepG2细胞为靶细胞,从效靶作用时间和效靶比方面进行优化,确定试验方法的最佳条件。结果采用CFSE/PI双标记将细胞分为CFSE^+PI-、CFSE^+PI^+、CFSE-PI^+和CFSE-PI-4个组群,可有效区分活细胞和被杀伤细胞。CFSE标记靶细胞的浓度采用2.5μmol/mL,效靶作用时间为12 h,效靶比10∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法,该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。

CFSE标记法分析番鸭呼肠孤病毒感染对番鸭回肠淋巴细胞归巢的影响

旨在建立一种可靠的体外活番鸭淋巴细胞的荧光标记方法,并用于分析番鸭呼肠孤病毒感染对雏番鸭回肠淋巴细胞归巢的影响。选择活细胞荧光染剂5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE,CFSE)对分离的番鸭淋巴细胞进行标记和利用流式细胞术对体外标记的淋巴细胞体内示踪检测分析,并利用该方法对MDRV感染雏番鸭回肠组织的淋巴细胞数量进行流式细胞术和石蜡切片免疫荧光检测分析;结果最终确定CFSE体外标记番鸭淋巴细胞的条件为以PBS为孵育液,终浓度10μmol·L^-1,37℃30 min;试验结果表明番鸭外周血内的CFSE+淋巴细胞率基本稳定在2%~5%,CFSE^+淋巴细胞峰值出现顺序依次为脾、空肠、回肠、盲肠、十二指肠、法氏囊和胸腺;此外,感染MDRV后1~10 d MDRV组中CFSE+淋巴细胞率极显著(P<0.01)高于MOCK组,该结果与α4+淋巴细胞率和石蜡切片免疫荧光检测结果一致。结果表明本试验CFSE标记的淋巴细胞可用于体内淋巴细胞示踪,初步应用结果提示MDRV感染促进番鸭淋巴细胞向回肠归巢,为进一步阐明MDRV感染的肠道组织致病机制奠定了基础。