转基因玉米MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR(dPCR)不依赖标准物质,实现对DNA分子的绝对定量,已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法,获得准确测量结果,本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料,探索建立二重微滴数字PCR(ddPCR)的策略。以构建的聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品,将5个不同的玉米内标基因分别与MON87427组合,通过优化退火温度,根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值的一致性等,确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb,最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb二重ddPCR的动力学范围为10~60000拷贝。对盲样进行定量检测,二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性,表明MON87427/zSSIIb二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。

二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立

为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,ARV阳性检出率为13.0%(12/92),MS阳性检出率为9.8%(9/92),混合感染阳性率为2.2%(2/92)。结果表明,本研究建立的二重ddPCR方法在定量检测ARV及MS时特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ARV及MS提供了更敏感的检测技术手段。

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础,是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料,其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料,对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测,按质量分数(以干基计)称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1000.0 mg·g^(-1)的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检,初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR(ddPCR)方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个浓度,粒径小于200μm的粉末大于80%,含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分装,不低于1.0 g/瓶,充氮后轧盖,3个浓度的标准物质各分装400瓶。3种标准物质均匀性检验的F值均小于临界值F0.05(14,30)(2.04),在瓶内和瓶间具有良好的均匀性,使用时,最小取样量为100 mg。标准物质在25℃、37℃和60℃条件下可稳定储存14 d,表明在常温下运输14 d标准物质特性量值不发生趋势性变化;在4℃和-20℃条件下长期稳定性达到12个月;开盖取样5次,标准物质特性量值未发生显著偏离。8家实验室联合测定的标准物质拷贝数比值无异常值、呈正态分布、且等精度,标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度分别为(2.92±0.44)%、(4.89±0.57)%、(52.1±3.4)%。【结论】研制的转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质均匀性良好,可稳定运输和储存,满足转基因玉米MON87427定性、定量检测需求,为转基因玉米MON87427的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。