禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立二重荧光定量RT-PCR方法,用于禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的检测。方法:根据AIV和NDV的基因保守序列,设计了AIV和NDV的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR方法。结果:所建方法特异性好,对AIV和NDV的检测敏感性均达到2000个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,对AIV和NDV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测2种病毒。对保存的AIV或NDV鸡胚尿囊液及临床病料进行二重荧光定量RT-PCR检测,结果尿囊液检测的拷贝数均达到1010/μL以上,临床病料的拷贝数为2.13×108～6.52×104/μL。结论:建立了用于检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对AIV和NDV的防制有重要意义。

通用型和O型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立通用型和O型口蹄疫病毒(FMDV)二重荧光定量RT-PCR检测方法,本试验根据GenBank已登录的不同亚型FMDV通用序列和O型FMDV序列设计了2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针,经过反应条件和体系优化,建立了通用型(T型)和O型FMDV的二重荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;对15份临床疑似样品进行了应用检测。结果表明,成功建立通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,该方法可特异性地扩增经灭活的O型、A型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒标准株细胞培养物混合物,但对BHK-21细胞和PEDV、TGEV、SVV等病原对照不出现特异性扩增曲线,特异性好;检测模板最低极限为1.0×101拷贝/μL,敏感性高,重复性好;自15份临床疑似FMDV感染样品中检出9份FMDV-T阳性,7份FMDV-O阳性,检测结果与测序结果完全一致,且与国家口蹄疫参考实验室复核结果一致。本试验成功建立了通用型和O型FMDV二重FQ-PCR检测方法,为FMDV的快速检测及O型FMDV的分型诊断提供了特异、敏感、快速的方法。

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

本试验旨在建立同时检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和鸭瘟病毒(DPV)的二重荧光定量RT-PCR方法。针对GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系、条件及评价其特异性、敏感性,建立了检测DTMUV和DPV的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法对DTMUV和DPV的检测灵敏度均达100个模板拷贝数,同时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。本研究建立的DTMUV和DPV二重荧光定量RT-PCR具有敏感、快速、特异、定量、重复性好等优点,可用于DTMUV和DPV感染的快速鉴别诊断。

鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。

布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。

PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究

为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达10~(1.33)~10~(2.13) copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。

一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒（NiV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSVnsp2基因的RNA标准对照（NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA）,线性范围分别为4.6×101-4.6×107和4.1×101-4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）发生交叉反应。用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性。本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。

猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原的目的基因并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1,并均经PCR和测序鉴定。将3种重组质粒标准品稀释到同一浓度1×10^(8)拷贝/μL,按体积比1∶1∶1混合后作为模板,采用方阵法优化各反应条件后,建立了检测上述病原的三重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。以FPV、FCV、FHV-1、猫博卡病毒、猫冠状病毒、猫支原体、猫白血病病毒、猫星状病毒的基因组为模板采用本研究建立的方法检测,评估该方法的特异性,结果显示,该方法仅能检测到FPV、FCV、FHV-1,而其他病原的检测结果均为阴性。选取1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(6)拷贝/μL的混合质粒标准品和10^(-0.5) TCID_(50)/mL~10^(5.5) TCID_(50)/mL的混合病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法检测重组质粒和病毒的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1的检测限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,对3种病毒的检测限均约为10^(0.5) TCID_(50)/mL;以1×10^(7)拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10^(3)拷贝/μL质粒标准品混合物作为模板分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于3%。利用建立的该三重荧光定量RT-PCR和常规PCR对81份临床样品(77份猫的眼、鼻、咽、肛混合拭子样品和4份组织病料样品)分别检测,结果显示三重荧光定量RT-PCR检测出47份FPV、13份FCV和13份FHV-1阳性样品,而常规PCR分别检测出39份FPV、9份FCV和6份FHV-1阳性样品,该三重荧光定量RT-PCR与FPV、FCV、FHV-1常规PCR的总符合率分别为90.12%、95.06%、92.59%。本研究建立的三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为FPV、FCV、FHV-1临床样品的快速鉴别检测提供了有力技术支持。

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S基因序列和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因序列,设计特异性的引物和探针。通过对引物和探针浓度等反应液用量以及反应条件等因素进行优化试验,建立了能同时鉴别检测TGEV和PEDV的二重荧光RT-PCR方法。用该方法同时检测其他病原如Po RV、PCV和CSFV时不发生交叉反应,特异性好;较普通PCR均高出3个数量级的敏感性,能够检测10 TGEV和10 PEDV拷贝数,敏感性高;组内重复和组间重复试验结果变异系数小,稳定性好;同时检测2个模板的不同浓度组合试验,干扰性小。本试验建立的二重荧光RT-PCR方法可用于TGEV和PEDV的鉴别检测,且具有特异、敏感、稳定、快速等优点,为进一步应用于TGEV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。

罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CP^(MrNV)和pGM-T-MCP^(DIV1)),其中,pGM-T-CP^(MrNV)用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCP^(DIV1)则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×10^(1)~1.0×10^(8)Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障。

四重荧光定量RT-PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒

将H7N9禽流感病毒HA和NA基因设为内部参考,并分别设计特异性探针和引物,分析不同来源呼吸道病毒的特异性,并对四重荧光定量RT-PCR检测方法的重复性和灵敏度进行评定。结果甲型H7N9禽流感病毒标本和RNase P检测灵敏度均为102copies/m L,特异性为99.7%,变异系数均低于2.20%,阳性符合率和阴性符合率均为100%。利用四重荧光定量RT-PCR检测H7N9病毒具有较高的灵敏度和特异性,且检测快速准确,对H7N9病毒感染者早期诊断有重要意义。